אימונאָמאָדולאַטאָרישע מעטאַבאָליטן זענען אַ שליסל שטריך פון דער טומאָר מיקראָ-סביבה (TME), אָבער מיט אַ פּאָר אויסנעמען, בלייבן זייערע אידענטיטעטן לאַרגעלי אומבאַקאַנט. דאָ, מיר האָבן אַנאַליזירט טומאָרן און T צעלן פון די טומאָרן און אַססיטעס פון פּאַטיענץ מיט הויך-גראַד סעראָוס קאַרסינאָמאַ (HGSC) צו אַנטדעקן דעם מעטאַבאָלאָם פון די פאַרשידענע TME אָפּטיילן. אַססיטעס און טומאָר צעלן האָבן ברייטע מעטאַבאָליט אונטערשיידן. קאַמפּערד מיט אַססיטעס, די טומאָר-ינפילטרייטינג T צעלן זענען באַדייטנד ענריטשט אין 1-מעטהילניקאָטינאַמיד (MNA). כאָטש דער מדרגה פון MNA אין T צעלן איז עלעוואַטעד, די אויסדרוק פון ניקאָטינאַמיד N-מעטהילטראַנספעראַסע (אַן ענזיים וואָס קאַטאַליזירט די אַריבערפירן פון מעטהיל גרופּעס פון S-אַדענאָסילמעטהיאָנין צו ניקאָטינאַמיד) איז לימיטעד צו פיבראָבלאַסטן און טומאָר צעלן. פאַנגקשאַנאַלי, MNA ינדוסיז T צעלן צו סעקרעטירן די טומאָר-פּראָמאָוטינג ציטאָקינע טומאָר נעקראָוסיס פאַקטאָר אַלפאַ. דעריבער, TME-דערייווד MNA קאַנטריביוץ צו די ימיון רעגולאַטיאָן פון T צעלן און רעפּראַזענץ אַ פּאָטענציעל ימיונאָטהעראַפּי ציל פֿאַר די באַהאַנדלונג פון מענטשלעך ראַק.
טומאָר-דעריוואַטעד מעטאַבאָליטן קענען האָבן אַ טיף ינכיבאַטאָרי ווירקונג אויף אַנטי-טומאָר ימיונאַטי, און מער און מער באַווייַזן ווייַזן אַז זיי קענען אויך דינען ווי אַ שליסל טרייבקראַפט פֿאַר קראַנקייט פּראָגרעס (1). אין אַדישאַן צו די וואַרבורג ווירקונג, לעצטע אַרבעט האט אנגעהויבן צו כאַראַקטערייז די מעטאַבאַליק שטאַט פון טומאָר סעלז און זיין שייכות מיט די ימיון שטאַט פון די טומאָר מיקראָענווייראָנמענט (TME). שטודיעס אויף מויז מאָדעלס און מענטשלעך ט סעלז האָבן געוויזן אַז גלוטאַמין מעטאַבאָליזאַם (2), אָקסידאַטיוו מעטאַבאָליזאַם (3) און גלוקאָזע מעטאַבאָליזאַם (4) קענען אַקט ינדיפּענדאַנטלי אויף פאַרשידן ימיון צעל סאַבגרופּס. עטלעכע מעטאַבאָליטן אין די פּאַטווייז ינכיבאַט די אַנטי-טומאָר פונקציע פון ​​ט סעלז. עס איז געווען באוויזן אַז די בלאַקייד פון די קאָענזיים טעטראַהידראָביאָפּטערין (BH4) קענען שעדיקן די פּראָוליפעריישאַן פון ט סעלז, און די פאַרגרעסערן פון BH4 אין די גוף קענען פֿאַרבעסערן די אַנטי-טומאָר ימיון ענטפער מעדיאַטעד דורך CD4 און CD8. אין אַדישאַן, די ימיונאָסופּרעסיוו ווירקונג פון קינורענין קענען זיין געראַטעוועט דורך די אַדמיניסטראַציע פון ​​BH4 (5). אין איזאָסיטראַט דעהידראָגענאַזע (IDH) מוטאַנט גליאָבלאַסטאָמאַ, די סעקרעציע פון ​​ענאַנטיאָמעטאַבאָליק (R)-2-הידראָקסיגלוטאַראַט (R-2-HG) ינכיבאַץ T צעל אַקטיוואַציע, פּראָליפעראַציע און ציטאָליזיס טעטיקייט (6). לעצטנס, עס איז געוויזן געוואָרן אַז מעטילגליאָקסאַל, אַ ביי-פּראָדוקט פון גליקאָליזיס, ווערט פּראָדוצירט דורך סאַפּרעססאָר סעלז פון מיעלאָיד אָפּשטאַם, און T צעל אַריבערפירן פון מעטילגליאָקסאַל קען ינכיבאַטירן עפעקטאָר T צעל פונקציע. אין באַהאַנדלונג, די נויטראַליזאַציע פון ​​מעטילגליאָקסאַל קען איבערקומען די טעטיקייט פון מיעלאָיד-דערייווד סאַפּרעססאָר סעלז (MDSC) און סינערגיסטיש פֿאַרבעסערן טשעקפּוינט בלאָקאַדע טעראַפּיע אין מויז מאָדעלס (7). די שטודיעס קאָלעקטיוולי ונטערשטרייַכן די שליסל ראָלע פון ​​TME-דערייווד מעטאַבאָלייץ אין רעגולירן T צעל פונקציע און טעטיקייט.
טי צעל דיספונקציע איז ברייט געמאלדן געוואָרן אין אָווועריאַן ראַק (8). דאָס איז טיילווייז רעכט צו די מעטאַבאַליק קעראַקטעריסטיקס וואָס זענען איינגעבוירן אין היפּאָקסיאַ און אַבנאָרמאַל טומאָר וואַסקולאַטור (9), וואָס רעזולטאַטן אין די קאַנווערזשאַן פון גלוקאָזע און טריפּטאָפאַן אין ביי-פּראָדוקטן אַזאַ ווי לאַקטיק זויער און קינורענין. יבעריק עקסטראַסעלולאַר לאַקטאַטע ראַדוסאַז די פּראָדוקציע פון ​​ינטערפעראָן-γ (IFN-γ) און טרייבט די דיפערענציאַציע פון ​​מיעלאָסאַפּרעסיוו סובגרופּס (10, 11). די קאַנסאַמשאַן פון טריפּטאָפאַן ינכיבאַץ גלייך טי צעל פּראָוליפעריישאַן און ינכיבאַץ טי צעל רעצעפּטאָר סיגנאַלינג (12-14). טראָץ די אָבסערוואַציעס, אַ פּלאַץ פון אַרבעט אַרום ימיון מעטאַבאָליזאַם איז געווען דורכגעפירט אין אין וויטראָ טי צעל קולטור ניצן אָפּטימיזעד מעדיע, אָדער לימיטעד צו כאָומאַלאַדזשיאַס מויז מאָדעלס אין וויוואָ, קיינער פון וואָס גאָר ריפלעקס די העטעראָגעניטי פון מענטשלעך ראַק און פיזיאַלאַדזשיקאַל מאַקראָ און מיקראָ סוויווע.
א געוויינטלעכע אייגנשאפט פון אָווועריאַן ראַק איז פּעריטאָנעאַלע פאַרשפּרייטונג און די אויסזען פון אַססיטעס. די אַקיומיאַליישאַן פון צעל פליסיק אין אַססיטעס איז פארבונדן מיט אַוואַנסירטע קראַנקייט און שלעכט פּראָגנאָז (15). לויט באַריכטן, איז דעם יינציקן אָפּטייל היפּאָקסיק, האט הויך לעוועלס פון וואַסקולאַר ענדאָטעליאַל גראָוט פאַקטאָר (VEGF) און ינדאָלעאַמין 2,3-דיאָקסידזשענאַזע (IDO), און איז ינפילטרירט דורך T רעגולאַטאָרי סעלז און מיעלאָיד ינכיבאַטאָרי סעלז (15-18). די מעטאַבאַליק סוויווע פון ​​אַססיטעס קען זיין אַנדערש פון דעם פון די טומאָר זיך, אַזוי די רעפּראָגראַממינג פון T סעלז אין די פּעריטאָנעאַל פּלאַץ איז נישט קלאָר. אין דערצו, די שליסל דיפעראַנסיז און העטעראָגעניטי צווישן אַססיטעס און מעטאַבאָליץ פאָרשטעלן אין די טומאָר סוויווע קען שטערן די ינפילטריישאַן פון ימיון סעלז און זייער פונקציע אויף טומאָרס, און ווייטערדיקע פאָרשונג איז דארף.
כּדי צו סאָלווען די פּראָבלעמען, האָבן מיר דיזיינט אַ סענסיטיווע צעל צעשיידונג און פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע טאַנדעם מאַסע ספּעקטראָמעטרי (LC-MS/MS) מעטאָד צו שטודירן פֿאַרשידענע צעל טיפּן (אַרייַנגערעכנט CD4 + און CD8 + T צעלן) ווי אויך אין און צווישן טומאָרן. אירע מעטאַבאָליטן שפּאַנען צעלן אין דער זעלביקער אַססיטעס און טומאָר סביבה פון דעם פּאַציענט. מיר נוצן דעם מעטאָד אין קאַנדזשאַנגקשאַן מיט הויך-דימענשאַנאַל פלאָו סיטאָמעטרי און איין-צעל RNA סיקוואַנסינג (scRNA-seq) צו צושטעלן אַ הויך-רעזאָלוועד פּאָרטרעט פון די מעטאַבאַליק סטאַטוס פון די שליסל פּאָפּולאַציעס. דעם מעטאָד האט געוויזן אַ באַטייטיק פאַרגרעסערונג אין די מדרגה פון 1-מעטהילניקאָטינאַמיד (MNA) אין טומאָר T צעלן, און אין וויטראָ עקספּערימענטן האָבן געוויזן אַז די ימיונאָמאָדולאַטאָרי ווירקונג פון MNA אויף T צעל פונקציע איז געווען פריער אומבאַקאַנט. אין אַלגעמיין, דעם מעטאָד אַנטפּלעקט די קעגנצייַטיק מעטאַבאַליק ינטעראַקשאַנז צווישן טומאָרן און ימיון צעלן, און גיט יינציק ינסייץ אין ימיון רעגולירן מעטאַבאָליטן, וואָס קען זיין נוציק פֿאַר די באַהאַנדלונג פון T צעל-באזירט אָווועריאַן ראַק ימיונאָטהעראַפּי באַהאַנדלונג אַפּערטונאַטיז.
מיר האָבן גענוצט הויך-דימענסיאָנעלע פלוס ציטאָמעטריע צו גלייכצייטיג קוואַנטיפיצירן גלוקאָזע אויפנאַם [2-(N-(7-ניטראָפעניל-2-אָקסאַ-1,3-דיאַזאַ-4-יל)אַמינאָ)-2-דעאָקסיגלוקאָז (2-NBDG) און מיטאָטשאָנדריאַלע טעטיקייט [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) זענען זייַט ביי זייַט טיפּישע מאַרקערס וואָס אונטערשיידן ימיון סעלז און טומאָר צעל פּאָפּולאַציעס (טאַבעלע S2 און פיגור S1A). די אַנאַליז האט געוויזן אַז קאַמפּערד מיט T סעלז, אַססיטעס און טומאָר סעלז האָבן העכער גלוקאָזע אויפנאַם לעוועלס, אָבער האָבן קלענערע דיפעראַנסיז אין מיטאָטשאָנדריאַלע טעטיקייט. די דורכשניטלעך גלוקאָזע אויפנאַם פון טומאָר סעלז [CD45-EpCAM (EpCAM)+] איז דריי צו פיר מאָל אַז פון T סעלז, און די דורכשניטלעך גלוקאָזע אויפנאַם פון CD4 + T סעלז איז 1.2 מאָל אַז פון CD8 + T סעלז, וואָס ינדיקייץ טומאָר ינפילטרייטינג לימפאָציטן (TIL) האָבן פאַרשידענע מעטאַבאַליק באדערפענישן אפילו אין די זעלבע TME (פיגור 1A). אין קאנטראסט, די מיטאכאנדריעלע טעטיקייט אין טומאר צעלן איז ענליך צו יענע פון ​​CD4 + T צעלן, און די מיטאכאנדריעלע טעטיקייט פון ביידע צעל טיפן איז העכער ווי יענע פון ​​CD8 + T צעלן (פיגור 1B). בכלל, די רעזולטאטן ווייזן דעם מעטאבאלישן לעוועל. די מעטאבאלישן טעטיקייט פון טומאר צעלן איז העכער ווי יענע פון ​​CD4 + T צעלן, און די מעטאבאלישן טעטיקייט פון CD4 + T צעלן איז העכער ווי יענע פון ​​CD8 + T צעלן. טראץ די עפעקטן איבער צעל טיפן, איז נישטא קיין קאנסיסטענטן אונטערשייד אין דעם מעטאבאלישן סטאטוס פון CD4 + און CD8 + T צעלן אדער זייערע רעלאטיווע פראפארציעס אין אססיטעס קאמפערד מיט טומארן (פיגור 1C). אין קאנטראסט, אין דער CD45-צעל פראקציע, איז דער פראפארציע פון ​​EpCAM+ צעלן אין דעם טומאר געוואקסן קאמפערד מיט אססיטעס (פיגור 1D). מיר האבן אויך באמערקט א קלארן מעטאבאלישן אונטערשייד צווישן EpCAM+ און EpCAM- צעל קאמפאנענטן. EpCAM+ (טומאר) צעלן האבן העכערע גלוקאז אויפנעמונג און מיטאכאנדריעלע טעטיקייט ווי EpCAM- צעלן, וואס איז פיל העכער ווי די מעטאבאלישן טעטיקייט פון פיבראבלאסטן אין טומאר צעלן אין TME (פיגור 1, E און F).
(A און B) מעדיאַן פלאָרעסענס אינטענסיטעט (MFI) פון גלוקאָזע אויפנאַם (2-NBDG) (A) און מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט פון CD4 + T צעלן (MitoTracker טונקל רויט) (B) רעפּרעזענטאַטיווע גראַפיקס (לינקס) און טאַביאַלייטיד דאַטן (רעכטס), CD8 + T צעלן און EpCAM + CD45-טומאָר צעלן פון אַססיטעס און טומאָר. (C) די פאַרהעלטעניש פון CD4 + און CD8 + צעלן (פון CD3 + T צעלן) אין אַססיטעס און טומאָר. (D) פּראָפּאָרציע פון ​​EpCAM + טומאָר צעלן אין אַססיטעס און טומאָר (CD45−). (E און F) EpCAM + CD45-טומאָר און EpCAM-CD45-מאַטריץ גלוקאָזע אויפנאַם (2-NBDG) (E) און מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט (MitoTracker טונקל רויט) (F) רעפּרעזענטאַטיווע גראַפיקס (לינקס) און טאַביאַלייטיד דאַטן (רעכטס) אַססיטעס און טומאָר צעלן. (G) רעפּרעזענטאַטיווע גראַפיקס פון CD25, CD137 און PD1 אויסדרוק דורך פלאָו סיטאָמעטרי. (H און I) CD25, CD137 און PD1 אויסדרוק אויף CD4 + T צעלן (H) און CD8 + T צעלן (I). (J און K) נאיוו, צענטראל זכּרון (Tcm), עפעקטאר (Teff) און עפעקטאר זכּרון (Tem) פענאטיפן באזירט אויף דער אויסדרוק פון CCR7 און CD45RO. רעפרעזענטאטיווע בילדער (לינקס) און טאבולארע דאטן (רעכטס) פון CD4 + T צעלן (J) און CD8 + T צעלן (K) אין אססיטעס און טומאָרן. P ווערטן באשטימט דורך געפּאָרטע t-טעסט (*P<0.05, **P<0.01 און ***P<0.001). די ליניע רעפּרעזענטירט געפּאַסטע פּאַציענטן (n = 6). FMO, פלואָרעסענץ מינוס איינס; MFI, מעדיאַן פלואָרעסענץ אינטענסיטעט.
ווייטערדיגע אנאליז האט אנטפלעקט אנדערע באדייטנדע אונטערשיידן צווישן דעם הויך-רעזאלוודן ט צעל פענאטיפישן סטאטוס. די אקטיוויזירטע (פיגור 1, G ביז I) און עפעקטאר זכרון (פיגור 1, J און K) אין טומאָרען זענען פיל מער אָפט ווי אַססיטעס (פּראָפּאָרציע פון ​​CD3 + ט צעלן). סימילאַרלי, אנאליזירן דעם פענאטיפ דורך די אויסדרוק פון אקטיוויזאציע מאַרקערס (CD25 און CD137) און דיפּלישאַן מאַרקערס [פּראָגראַמירט צעל טויט פּראָטעין 1 (PD1)] האט געוויזן אַז כאָטש די מעטאַבאַליק קעראַקטעריסטיקס פון די פּאָפּולאַציעס זענען אַנדערש (פיגור S1, B ביז E), אָבער קיין באדייטנדע מעטאַבאַליק אונטערשיידן זענען קאָנסיסטענטלי באמערקט צווישן נאַיוו, עפעקטאר אָדער זכרון סאַבסעץ (פיגור S1, F ביז I). די רעזולטאַטן זענען באשטעטיקט דורך ניצן מאַשין לערנען מעטהאָדס צו אויטאָמאַטיש אַסיינ צעל פענאטיפּעס (21), וואָס ווייטער אנטפלעקט די בייַזייַן פון אַ גרויס נומער פון ביין מאַרך צעלן (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) אין די פּאַציענט 'ס אַססיטעס (פיגור S2A). צווישן אלע אידענטיפיצירטע צעל טיפן, האט די מיעלאָיד צעל פאפולאציע געוויזן די העכסטע גלוקאז אויפנעמע און מיטאכאנדריעל טעטיקייט (פיגור S2, B ביז G). די רעזולטאטן אונטערשטרייכן די שטארקע מעטאבאלישע אונטערשיידן צווישן די פארשידענע צעל טיפן געפונען אין אססיטעס און טומארן אין HGSC פאציענטן.
די הויפּט אַרויסרופן אין פֿאַרשטיין די מעטאַבאָנאָמישע קעראַקטעריסטיקס פון TIL איז די נויטווענדיקייט צו אפגעזונדערן T צעל מוסטערן פון גענוג ריינקייט, קוואַליטעט און קוואַנטיטעט פון טומאָרס. לעצטע שטודיעס האָבן געוויזן אַז סאָרטינג און בעדל ענריטשמענט מעטהאָדס באַזירט אויף פלאָו סיטאָמעטרי קען פירן צו ענדערונגען אין סעליאַלער מעטאַבאָליט פּראָופיילז (22-24). צו באַקומען דעם פּראָבלעם, מיר אָפּטימיזעד די בעדל ענריטשמענט אופֿן צו אפגעזונדערן און אפגעזונדערן TIL פון כירורגיש רעסעקטעד מענטשלעך אָווועריאַן ראַק איידער אַנאַליסיס דורך LC-MS/MS (זען מאַטעריאַלס און מעטהאָדס; פיגור 2A). כּדי צו אַססעסס די קוילעלדיק פּראַל פון דעם פּראָטאָקאָל אויף מעטאַבאָליט ענדערונגען, מיר קאַמפּערד די מעטאַבאָליט פּראָופיילז פון T סעלז אַקטיווייטיד דורך געזונט דאָנאָרס נאָך די אויבן בעדל סעפּאַריישאַן שריט מיט סעלז וואָס זענען נישט בעדל סעפּאַרייטיד אָבער פארבליבן אויף אייז. דעם קוואַליטעט קאָנטראָל אַנאַליסיס געפונען אַז עס איז אַ הויך קאָרעלאַציע צווישן די צוויי באדינגונגען (r = 0.77), און די טעכניש ריפּיטאַביליטי פון די גרופּע פון ​​86 מעטאַבאָליץ האט הויך ריפּיטאַביליטי (פיגור 2B). דעריבער, קענען די מעטאָדן דורכפירן גענויע מעטאַבאָליט אַנאַליז אין צעלן וואָס גייען דורך צעל טיפּ ענריטשמענט, אַזוי צושטעלן די ערשטע הויך-רעזאָלוציע פּלאַטפאָרמע פֿאַר אידענטיפיצירן ספּעציפֿישע מעטאַבאָליטן אין HGSC, דערמיט דערמעגלעכן מענטשן צו באַקומען אַ טיפֿערע פארשטאנד פון צעל ספּעציפֿישקייט סעקסואַל מעטאַבאָליזם פּראָגראַם.
(א) סכעמאטישע דיאגראם פון מאַגנעטישע בעדל ענריטשמענט. פאר אנאליז דורך LC-MS/MS, וועלן די צעלן דורכגיין דריי קאנסעקוטיווע רונדעס פון מאַגנעטישע בעדל ענריטשמענט אדער בלייבן אויף אייז. (ב) דער עפעקט פון ענריטשמענט טיפ אויף דער שעפע פון ​​מעטאבאליטן. דער דורכשניט פון דריי מעסטונגען פאר יעדן ענריטשמענט טיפ ± SE. די גרויע ליניע רעפרעזענטירט א 1:1 באציאונג. די אינטרא-קלאס קארעלאציע (ICC) פון איבערגעחזרטע מעסטונגען געוויזן אין די אַקס לייבל. NAD, ניקאטינאַמיד אַדענין דינוקלעאָטיד. (ג) סכעמאטישע דיאגראם פון די וואָרקפלאָו פון פּאַציענט מעטאבאליט אנאליז. אַססיטעס אדער טומאָרס ווערן געזאמלט פון פּאַציענטן און קריאָפּרעזערווירט. א קליין טייל פון יעדן מוסטער איז געווארן אנאליזירט דורך פלוס סיטאָמעטרי, בשעת די איבעריגע מוסטערן האבן דורכגעגאנגען דריי רונדעס פון ענריטשמענט פאר CD4+, CD8+ און CD45- צעלן. די צעל פראַקשאַנז זענען געווארן אנאליזירט ניצן LC-MS/MS. (ד) היץ מאַפּע פון ​​סטאַנדאַרדיזירטער מעטאבאליט שעפע. די דענדראָגראַם רעפרעזענטירט וואָרד'ס קלאַסטערינג פון עוקלידישע דיסטאַנסעס צווישן מוסטערן. (E) הויפּט קאָמפּאָנענט אַנאַליז (PCA) פון מוסטער מעטאַבאָליט מאַפּע, ווייַזנדיק דריי רעפּליקאַטן פון יעדער מוסטער, מוסטערן פון דעם זעלבן פּאַציענט זענען פארבונדן דורך אַ ליניע. (F) די PCA פון דעם מעטאַבאָליט פּראָפיל פון דעם מוסטער קאַנדישאַנד אויף דעם פּאַציענט (ד"ה, ניצן טיילווייזע רעדאַנדאַנס); דער מוסטער טיפּ איז באַגרענעצט דורך די קאָנוועקס כאַל. PC1, הויפּט קאָמפּאָנענט 1; PC2, הויפּט קאָמפּאָנענט 2.
ווייטער, האבן מיר אנגעווענדעט דעם אנרייכערונג מעטאד צו אנאליזירן 99 מעטאבאליטן אין די CD4 +, CD8 + און CD45-צעל פראקציעס אין די ערשטיקע אססיטעס און טומארן פון זעקס HGSC פאציענטן (פיגור 2C, פיגור S3A און טאבעלע S3 און S4). די פאפולאציע פון ​​אינטערעסע מאכט אויס 2% ביז 70% פון דער אריגינעלער גרויסער מוסטער פון לעבעדיגע צעלן, און די פראפארציע פון ​​צעלן ווערירט שטארק צווישן פאציענטן. נאך צעשיידן די בעדס, מאכט די אנרייכערטע פראקציע פון ​​אינטערעסע (CD4+, CD8+ אדער CD45-) אויס מער ווי 85% פון אלע לעבעדיגע צעלן אין דער מוסטער אין דורכשניט. דעם אנרייכערונג מעטאד ערלויבט אונז צו אנאליזירן צעל פאפולאציעס פון מענטשליכן טומאר געוועב מעטאבאליזם, וואס איז אוממעגלעך צו טאן פון גרויסע מוסטערן. ניצנדיג דעם פראטאקאל, האבן מיר באשלאסן אז l-kynurenine און adenosine, די צוויי גוט-כאראקטעריזירטע אימונאסאפּרעסיווע מעטאבאליטן, זענען געווען עלעווירט אין טומאר T צעלן אדער טומאר צעלן (פיגור S3, B און C). דעריבער, דעמאנסטרירן די רעזולטאטן די געטריישאפט און פעאיקייט פון אונזער צעל צעשיידונג און מאסע ספעקטראמעטרי טעכנאלאגיע צו געפינען ביאלאגיש וויכטיגע מעטאבאליטן אין פאציענט געוועבן.
אונדזער אנאליז האט אויך אנטפלעקט א שטארקע מעטאבאלישע צעשיידונג פון צעל טיפן אינערהאלב און צווישן פאציענטן (פיגור 2D און פיגור S4A). ספעציעל, אין פארגלייך מיט אנדערע פאציענטן, האט פאציענט 70 געוויזן אנדערע מעטאבאלישע אייגנשאפטן (פיגור 2E און פיגור S4B), וואס ווייזט אז עס קען זיין א באדייטנדע מעטאבאלישע העטעראגעניטי צווישן פאציענטן. עס איז ווערט צו באמערקן אז אין פארגלייך מיט אנדערע פאציענטן (1.2 ביז 2 ליטער; טאבעלע S1), איז די גאנצע צאל אססיטעס וואס איז געזאמלט געווארן אין פאציענט 70 (80 מל) געווען קלענער. די קאנטראל פון אינטער-פאציענט העטעראגעניטי בעת הויפט קאמפאנענט אנאליז (למשל, ניצן טיילווייזע רעדאנדאניז) ווייזט קאנסיסטענטע ענדערונגען צווישן צעל טיפן, און די צעל טיפן און/אדער מיקרא-אומגעבונג זענען קלאר צוזאמענגעשטעלט לויטן מעטאבאליט פראפיל (פיגור 2F). די אנאליז פון איין מעטאבאליטן האט אונטערגעשטראכן די עפעקטן און אנטפלעקט באדייטנדע אונטערשיידן צווישן צעל טיפן און מיקרא-אומגעבונג. עס איז ווערט צו באמערקן אז דער מערסט עקסטרעמער אונטערשייד וואס איז באמערקט געווארן איז MNA, וואס איז געווענליך ענריטשט אין CD45- צעלן און אין CD4+ און CD8+ צעלן וואס אינפילטרירן דעם טומאר (פיגור 3A). פֿאַר CD4 + צעלן, איז דער עפֿעקט מערסט קלאָר, און די MNA אין CD8 + צעלן שיינט אויך צו זיין שטאַרק באַאיינפֿלוסט פֿון דער סבֿיבֿה. אָבער, דאָס איז נישט וויכטיק, ווייל בלויז דריי פֿון די זעקס פּאַציענטן קענען ווערן עוואַלויִרט פֿאַר טומאָר CD8+ סקאָרס. אין דערצו צו MNA, אין פֿאַרשידענע טיפּן צעלן אין אַססיטעס און טומאָרן, זענען אַנדערע מעטאַבאָליטן וואָס זענען שוואַך כאַראַקטעריזירט אין TIL אויך דיפֿערענציעל רייך (פֿיגורן S3 און S4). דעריבער, אַנטפּלעקן די דאַטן אַ פֿאַרשפּרעכנדיקן סכום פֿון אימונאָמאָדולאַטאָרישע מעטאַבאָליטן פֿאַר ווייטערדיקע פֿאָרשונג.
(א) נאָרמאַליזירטער אינהאַלט פון MNA אין CD4+, CD8+ און CD45- צעלן פון אַססיטעס און טומאָר. די קעסטל פּלאָט ווייזט די מעדיאַן (ליניע), אינטערקוואַרטיל קייט (פֿרэйם הינגע) און דאַטן קייט, ביז 1.5 מאָל די אינטערקוואַרטיל קייט (פֿרэйם וויסקער). ווי באַשריבן אין פּאַציענט מאַטעריאַלס און מעטהאָדס, נוצן די פּאַציענט ס לימאַ ווערט צו באַשטימען די P ווערט (*P<0.05 און **P<0.01). (ב) סכעמאַטיש דיאַגראַמע פון ​​MNA מעטאַבאָליזאַם (60). מעטאַבאָליטן: S-אַדענאָסיל-1-מעטהיאָנין; SAH, S-אַדענאָסין-1-האָמאָסיסטין; NA, ניקאָטינאַמיד; MNA, 1-מעטהילניקאָטינאַמיד; 2-PY, 1-מעטהיל-2-פּירידאָן-5-קאַרבאָקסאַמיד; 4-PY, 1-מעטהיל-4-פּירידאָן-5-קאַרבאָקסאַמיד; NR, ניקאָטינאַמיד ריבאָזע; NMN, ניקאָטינאַמיד מאָנאָנוקלעאָטיד. ענזימען (גרין): NNMT, ניקאטינאַמיד N-מעטהילטראַנספעראַזע; SIRT, סירטואינס; NAMPT, ניקאטינאַמיד פאָספאָריבאָסיל טראַנספעראַזע; AOX1, אַלדעהייד אָקסידאַזע ​​1; NRK, ניקאטינאַמיד ריבאָסייד קינאַזע; NMNAT, ניקאטינאַמיד מאָנאָ נוקלעאָטיד אַדענילאַט טראַנספעראַזע; Pnp1, פּורין נוקלעאָסייד פאָספאָרילאַזע. (C) t-SNE פון scRNA-seq פון אַססיטעס (גרוי) און טומאָר (רויט; n = 3 פּאַציענטן). (D) NNMT אויסדרוק אין פאַרשידענע צעל פּאָפּולאַציעס אידענטיפיצירט מיט scRNA-seq. (E) אויסדרוק פון NNMT און AOX1 אין SK-OV-3, מענטשלעכע עמבריאָניק ניר (HEK) 293T, T צעלן און MNA-באַהאַנדלטע T צעלן. די פאָולדיד אויסדרוק איז געוויזן אין באַצוג צו SK-OV-3. די אויסדרוק מוסטער מיט SEM איז געוויזן (n = 6 געזונטע דאָנאָרס). Ct ווערטן גרעסער ווי 35 זענען באַטראַכט ווי אַנדיטעקטאַבאַל (UD). (F) אויסדרוק פון SLC22A1 און SLC22A2 אין SK-OV-3, HEK293T, ט צעלן און ט צעלן באהאנדלט מיט 8mM MNA. די צוזאמענגעלייגטע אויסדרוק ווערט געוויזן אין באַצוג צו SK-OV-3. דער אויסדרוק מוסטער מיט SEM ווערט געוויזן (n = 6 געזונטע דאָנאָרס). Ct ווערטן גרעסער ווי 35 ווערן באַטראַכט ווי נישט דעטעקטאַבאַל (UD). (G) צעל MNA אינהאַלט אין אַקטיווירטע געזונטע דאָנאָר ט צעלן נאָך 72 שעה פון אינקובאַציע מיט MNA. דער אויסדרוק מוסטער מיט SEM ווערט געוויזן (n = 4 געזונטע דאָנאָרס).
MNA ווערט פראדוצירט דורך טראנספערירן די מעטיל גרופע פון ​​S-אדענאסיל-1-מעטהיאנין (SAM) צו ניקאטינעמיד (NA) דורך ניקאטינעמיד N-מעטהילטרענספעראז (NNMT; פיגור 3B). NNMT איז איבער-אויסגעדריקט אין א פארשיידנקייט פון מענטשלעכע קענסערס און איז פארבונדן מיט פראליפעראציע, אינוואזיע און מעטאסטאזיס (25-27). כדי בעסער צו פארשטיין די מקור פון MNA אין T צעלן אין TME, האבן מיר גענוצט scRNA-seq צו כאראקטעריזירן די אויסדרוק פון NNMT איבער צעל טיפן אין די אססיטעס און טומארן פון דריי HGSC פאציענטן (טאבעלע S5). אנאליז פון בערך 6,500 צעלן האט געוויזן אז אין אססיטעס און טומאר סביבות, איז NNMT אויסדרוק געווען באגרענעצט צו די פארגעשטימטע פיבראבלאסט און טומאר צעל פאפולאציעס (פיגור 3, C און D). עס איז ווערט צו באמערקן אז עס איז נישטא קיין קלארע NNMT אויסדרוק אין קיין פאפולאציע וואס אויסדריקט PTPRC (CD45 +) (פיגור 3D און פיגור S5A), וואס ווייזט אז די MNA דעטעקטירט אין די מעטאבאלייט ספעקטרום איז געווארן איינגעפירט אין T צעלן. די אויסדרוק פון אַלדעכיד אָקסידאַז 1 (AOX1) קאָנווערטירט MNA אין 1-מעטהיל-2-פּירידאָן-5-קאַרבאָקסאַמיד (2-PYR) אָדער 1-מעטהיל-4-פּירידאָן-5-קאַרבאָקסאַמיד (4-PYR); פיגור 3B) איז אויך באַגרענעצט צו דער פּאָפּולאַציע פון ​​פיבראָבלאַסטן וואָס אויסדריקן COL1A1 (פיגור S5A), וואָס צוזאַמען ווייַזן אַז T סעלז פעלן די פיייקייט פון קאַנווענשאַנאַל MNA מעטאַבאָליזאַם. די אויסדרוק מוסטער פון די MNA-פֿאַרבונדענע גענעס איז געווען וועראַפייד ניצן אַ צווייט אומאָפּהענגיק צעל דאַטן שטעלן פון אַססיטעס פון HGSC פּאַטיענץ (פיגור S5B; n = 6) (16). אין דערצו, קוואַנטיטאַטיווע פּאָלימעראַזע קייט רעאַקציע (qPCR) אַנאַליסיס פון געזונט דאָנאָר T סעלז באהאנדלט מיט MNA האט געוויזן אַז קאַמפּערד מיט קאָנטראָל SK-OV-3 אָווועריאַן טומאָר סעלז, NNMT אָדער AOX1 איז כּמעט נישט אויסגעדריקט (פיגור 3E). די אומגעריכט רעזולטאַטן ווייַזן אַז MNA קען זיין סעקרעטעד פון פיבראָבלאַסטן אָדער טומאָרס אין שכנים T סעלז אין TME.
כאָטש קאַנדידאַטן אַרייַננעמען די משפּחה פון אָרגאַנישע קאַטיאָן טראַנספּאָרטערס 1 ביז 3 (OCT1, OCT2 און OCT3) קאָדירט דורך די סאַליאַבאַל טרעגער 22 (SLC22) משפּחה (SLC22A1, SLC22A2 און SLC22A3), די פּאָטענציעלע טראַנספּאָרטערס פון MNA זענען נאָך נישט דעפינירט (28). QPCR פון mRNA פון געזונטע דאָנאָר T סעלז האָבן געוויזן נידעריקע אויסדרוק לעוועלס פון SLC22A1 אָבער נישט דעטעקטאַבאַל לעוועלס פון SLC22A2, וואָס האָט באַשטעטיקט אַז עס איז פריער געווען געמאלדן אין דער ליטעראַטור (פיגור 3F) (29). אין קאַנטראַסט, די SK-OV-3 אָווועריאַן טומאָר צעל ליניע האָט אויסגעדריקט הויך לעוועלס פון ביידע טראַנספּאָרטערס (פיגור 3F).
כּדי צו פּרובירן די מעגלעכקייט פון T צעלן וואָס האָבן די פיייקייט צו אַבזאָרבירן פרעמדע MNA, זענען געזונטע דאָנאָר T צעלן קאָלטיווירט געוואָרן פֿאַר 72 שעה אין דער אנוועזנהייט פון פאַרשידענע קאָנצענטראַציעס פון MNA. אין דער אָפּוועזנהייט פון עקסאָגענאָוס MNA, קען דער צעלולער אינהאַלט פון MNA נישט דעטעקטירט ווערן (פיגור 3G). אָבער, אַקטיוויירטע T צעלן באַהאַנדלט מיט עקסאָגענאָוס MNA האָבן געוויזן אַ דאָזע-אָפּהענגיקע פאַרגרעסערונג אין MNA אינהאַלט אין די צעלן, ביז 6 mM MNA (פיגור 3G). דאָס רעזולטאַט ווייַזט אַז טראָץ דעם נידעריקן מדרגה פון טראַנספּאָרטער אויסדרוק און מאַנגל פון דעם הויפּט ענזיים פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר ינטראַסעלולאַר MNA מעטאַבאָליזאַם, קען TIL נאָך אויפנעמען MNA.
דער ספּעקטרום פון מעטאַבאָליטן אין פּאַציענטן'ס טי צעלן און אין וויטראָ MNA אַבזאָרפּשאַן עקספּערימענטן פאַרגרעסערן די מעגלעכקייט אַז ראַק-פֿאַרבונדענע פיבראָבלאַסטן (CAF) סעקרעטירן MNA און טומאָר צעלן קען רעגולירן די פענאָטיפּ און פונקציע פון ​​TIL. צו באַשטימען די ווירקונג פון MNA אויף טי צעלן, געזונט דאָנאָר טי צעלן זענען אַקטיווייטיד אין וויטראָ אין דער בייַזייַן אָדער אַוועק פון MNA, און זייער פּראָליפעריישאַן און ציטאָקין פּראָדוקציע זענען עוואַלואַטעד. נאָך 7 טעג פון צוגעבן MNA אין דער העכסטער דאָזע, די באַפעלקערונג דאַבלינג נומער איז געווען מאַדעראַטלי רידוסט, בשעת קראַפט איז מיינטיינד אין אַלע דאָסעס (פיגור 4A). אין אַדישאַן, באַהאַנדלונג פון עקסאָגענאָוס MNA ריזאַלטיד אין אַ פאַרגרעסערן אין די פּראָפּאָרציע פון ​​CD4 + און CD8 + טי צעלן יקספּרעסינג טומאָר נעקראָוסיס פאַקטאָר-α (TNFα; פיגור 4B). אין קאַנטראַסט, די ינטראַסעלולאַר פּראָדוקציע פון ​​IFN-γ איז געווען באַטייטיק רידוסט אין CD4 + טי צעלן, אָבער נישט אין CD8 + טי צעלן, און עס איז געווען קיין באַטייטיק ענדערונג אין ינטערלויקין 2 (IL-2; פיגור 4, C און D). דעריבער, ענזיים-געבונדן אימונאָסאָרבענט אַסיי (ELISA) פון סופּערנאַטאַנץ פון די MNA-באַהאַנדלטע T צעל קולטורן האט געוויזן אַ באַטייטיק פאַרגרעסערונג אין TNFα, אַ פאַרקלענערונג אין IFN-γ, און קיין ענדערונג אין IL-2 (פיגור 4, E צו G). די פאַרקלענערונג פון IFN-γ ינדיקייץ אַז MNA קען שפּילן אַ ראָלע אין ינכיבאַטינג די אַנטי-טומאָר טעטיקייט פון T סעלז. כּדי צו סימולירן דעם ווירקונג פון MNA אויף T צעל-מעדיאַטעד ציטאָטאָקסיסיטי, כימעריק אַנטיגען רעסעפּטאָר T (FRα-CAR-T) סעלז וואָס צילן פאָלאַטע רעסעפּטאָר α און CAR-T (GFP) רעגולירט דורך גרין פלורעסאַנט פּראָטעין (GFP) -CAR-T) סעלז זענען געשאפן דורך געזונט דאָנאָר פּעריפעראַל בלוט מאָנאָנוקלעאַר סעלז (PBMC). CAR-T סעלז זענען קאַלטשערד פֿאַר 24 שעה אין דער בייַזייַן פון MNA, און דערנאָך קאָ-קאַלטשערד מיט מענטשלעך SK-OV-3 אָווועריאַן טומאָר סעלז וואָס יקספּרעסינג פאָלאַטע רעסעפּטאָר α אין אַן עפעקטאָר צו ציל פאַרהעלטעניש פון 10:1. MNA באַהאַנדלונג האָט רעזולטירט אין אַ באַדייטנדיקער פאַרקלענערונג אין דער טויטלעכער טעטיקייט פון FRα-CAR-T צעלן, וואָס איז געווען ענלעך צו FRα-CAR-T צעלן באַהאַנדלט מיט אַדענאָסין (פיגור 4H).
(א) גאַנץ לעבעדיק צעל צייל און באַפעלקערונג פאַרדאָפּלינג (PD) גלייך פֿון קולטור אויף טאָג 7. די באַר גראַפיק רעפּרעזענטירט די דורכשניטלעך + SEM פֿון זעקס געזונטע דאָנאָרס. רעפּרעזענטירט דאַטן פֿון לפּחות n = 3 אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. (ב ביז ד) CD3/CD28 און IL-2 זענען געניצט געוואָרן צו אַקטיווירן T צעלן ביי זייערע ריספּעקטיווע MNA קאָנצענטראַציעס פֿאַר 7 טעג. פֿאַר אַנאַליז, צעלן זענען סטימולירט געוואָרן מיט PMA/יאָנאָמיצין מיט GolgiStop פֿאַר 4 שעה. TNFα (ב) אויסדרוק אין T צעלן. בייַשפּיל בילד (לינקס) און טאַבולאַר דאַטן (רעכטס) פֿון TNFα אויסדרוק אין לעבעדיקע צעלן. IFN-γ (C) און IL-2 (D) אויסדרוק אין T צעלן. די אויסדרוק פֿון ציטאָקינען איז געמאָסטן געוואָרן דורך פֿלוס ציטאָמעטריע. די באַר גראַפיק רעפּרעזענטירט די דורכשניטלעך (n = 6 געזונטע דאָנאָרס) + SEM. ניצט איין-וועג אַנאַליז פֿון וואַריאַנס און ריפּיטיד מעסטונגען (*P<0.05 און **P<0.01) צו באַשטימען די P ווערט. רעפּרעזענטירט דאַטן פֿון לפּחות n = 3 אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. (E צו G) CD3/CD28 און IL-2 זענען גענוצט געוואָרן צו אַקטיוויזירן T צעלן ביי זייערע ריספּעקטיווע MNA קאָנצענטראַציעס פֿאַר 7 טעג. דער מעדיום איז געזאַמלט געוואָרן פֿאַר און נאָך 4 שעה פון PMA/יאָנאָמיצין סטימולאַציע. די קאָנצענטראַציעס פון TNFα (E), IFN-γ (F) און IL-2 (G) זענען געמאָסטן געוואָרן דורך ELISA. דער באַר גראַפיק רעפּרעזענטירט דעם דורכשניט (n = 5 געזונטע דאָנאָרס) + SEM. P ווערט באַשטימט מיט איין-וועג אַנאַליז פון וואַריאַנס און ריפּיטיד מעסטונגען (*P<0.05). די פּונקטירטע ליניע ווייזט די דעטעקציע לימיט פון די דעטעקציע. (H) צעל ליזיס אַסיי. FRα-CAR-T אָדער GFP-CAR-T צעלן זענען אַדזשאַסטיד מיט אַדענאָסין (250μM) אָדער MNA (10 mM) פֿאַר 24 שעה, אָדער לינקס אַנבאַהאַנדלט (Ctrl). דער פּראָצענט טייטן פון SK-OV-3 צעלן איז געמאָסטן געוואָרן. P ווערט באַשטימט דורך וועלטש t טעסט (*P<0.5 און **P<0.01).
כּדי צו באַקומען אַ מעכאַניסטיש פֿאַרשטאַנד פֿון MNA-אָפּהענגיקער TNFα אויסדרוק רעגולאַציע, זענען די ענדערונגען אין TNFα mRNA פֿון MNA-באַהאַנדלטע T צעלן עוואַלויִרט געוואָרן (פֿיגור 5A). געזונטע דאָנאָר T צעלן באַהאַנדלט מיט MNA האָבן געוויזן אַ צווייפֿאַכיקע פאַרגרעסערונג אין TNFα טראַנסקריפּציע לעוועלס, וואָס ווײַזט אַז MNA איז אָפּהענגיק פֿון TNFα טראַנסקריפּציאָנעלער רעגולאַציע. כּדי צו אויספֿאָרשן דעם מעגלעכן רעגולאַטאָרישן מעקאַניזם, זענען צוויי באַקאַנטע טראַנסקריפּציע פֿאַקטאָרן וואָס רעגולירן TNFα, נעמלעך אַקטיוויירטער T צעל נוקלעאַרער פֿאַקטאָר (NFAT) און ספּעציפֿישער פּראָטעין 1 (Sp1), עוואַלויִרט געוואָרן אין ענטפֿער צו MNA בינדונג צו דעם פּראָקסימאַלן TNFα פּראָמאָטער (30). דער TNFα פּראָמאָטער כּולל 6 אידענטיפֿיצירטע NFAT בינדונג זייטלעך און 2 Sp1 בינדונג זייטלעך, וואָס אָוווערלאַפּן זיך אין איין זייטל [-55 באַזע פּערז (bp) פֿון דעם 5'קאַפּ] (30). כראָמאַטין יממונאָפּרעסיפּיטאַציע (ChIP) האָט געוויזן אַז ווען באַהאַנדלט מיט MNA, איז די בינדונג פֿון Sp1 צו דעם TNFα פּראָמאָטער פֿאַרגרעסערט געוואָרן דרייפֿאַכיק. די אינקאָרפּאָראַציע פֿון NFAT איז אויך פֿאַרגרעסערט געוואָרן און האָט זיך דערנענטערט צו וויכטיקייט (פֿיגור 5B). די דאַטן ווײַזן אַז MNA רעגולירט די אויסדרוק פון TNFα דורך Sp1 טראַנסקריפּציע, און צו אַ קלענערער מאָס די אויסדרוק פון NFAT.
(א) אין פאַרגלייך מיט ט צעלן קאָלטיווירט אָן MNA, די פאַרשיידנקייט פון TNFα אויסדרוק אין ט צעלן באַהאַנדלט מיט MNA. די אויסדרוק מוסטער מיט SEM איז געוויזן (n = 5 געזונטע דאָנאָרס). רעפּרעזענטירט דאַטן פון לפּחות n = 3 אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. (ב) דער TNFα פּראָמאָטער פון ט צעלן באַהאַנדלט מיט אָדער אָן 8 mM MNA נאָך NFAT און Sp1 זענען קאַמביינד מיט (Ctrl) און PMA/יאָנאָמיצין סטימולאַציע פֿאַר 4 שעה. יממונאָגלאָבולין G (IgG) און H3 זענען געניצט ווי נעגאַטיווע און פּאָזיטיווע קאָנטראָלן פֿאַר יממונאָפּרעסיפּיטאַציע, ריספּעקטיוולי. די קוואַנטיפיקאַציע פון ​​ChIP האט געוויזן אַז די ביינדינג פון Sp1 און NFAT צו די TNFα פּראָמאָטער אין MNA-באַהאַנדלט צעלן געוואקסן עטלעכע מאָל קאַמפּערד מיט די קאָנטראָל. רעפּרעזענטירט דאַטן פון לפּחות n = 3 אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. P ווערט באַשטימט דורך קייפל t-טעסטן (*** P <0.01). (C) אין פאַרגלייך מיט די אַססיטעס פון HGSC, ט צעלן (נישט-ציטאָטאָקסיק) האָבן געוויזן געוואקסן אויסדרוק פון TNF אין די טומאָר. די פארבן רעפּרעזענטירן פאַרשידענע פּאַטיענץ. די אויסגעוויזענע צעלן זענען ראַנדאָם געסאַמפּלט געוואָרן צו 300 און דזשיטערד צו באַגרענעצן אָוווערדראָינג (** פּאַדדזש = 0.0076). (ד) פארגעשלאגענער מאָדעל פון MNA פֿאַר אָווועריאַן ראַק. MNA ווערט פּראָדוצירט אין טומאָר צעלן און פיבראָבלאַסטן אין TME און ווערט אויפגענומען דורך T צעלן. MNA פאַרגרעסערט די בינדונג פון Sp1 צום TNFα פּראָמאָטער, וואָס פירט צו פאַרגרעסערטע TNFα טראַנסקריפּציע און TNFα ציטאָקין פּראָדוקציע. MNA פאַראורזאַכט אויך אַ פאַרקלענערונג אין IFN-γ. אינהיביציע פון ​​T צעל פונקציע פירט צו פאַרקלענערטע טייטן פיייקייט און אַקסעלערירט טומאָר וווּקס.
לויט באריכטן, האט TNFα פראנט און הינטן-אפהענגיקע אנטי-טומאר און אנטי-טומאר עפעקטן, אבער עס האט א באוואוסטע ראלע אין פראמאטירן דעם וואוקס און מעטאסטאז פון אייוועריאנישן קענסער (31-33). לויט באריכטן, איז די קאנצענטראציע פון ​​TNFα אין אססיטעס און טומאר געוועבן אין פאציענטן מיט אייוועריאנישן קענסער העכער ווי אין גוט-ארטיקע געוועבן (34-36). אין טערמינען פון מעכאניזם, קען TNFα רעגולירן די אקטיוואציע, פונקציע און פראליפעראציע פון ​​ווייסע בלוט צעלן, און ענדערן דעם פענאטיפ פון קענסער צעלן (37, 38). אין איינקלאנג מיט די דאזיגע געפינסן, האט דיפערענציעלע גענע אויסדרוק אנאליז געוויזן אז TNF איז געווען באדייטנד פארגרעסערט אין T צעלן אין טומאר געוועבן אין פארגלייך מיט אססיטעס (פיגור 5C). די פארגרעסערונג אין TNF אויסדרוק איז נאר געווען קענטיק אין T צעל פאפולאציעס מיט א נישט-ציטאטאקסישן פענאטיפ (פיגור S5A). אין קורצן, שטיצן די דאטן די מיינונג אז MNA האט צווייענדיקע אימונאסאפּרעסיווע און טומאר פראמאטירנדע עפעקטן אין HGSC.
פלואָרעסצענט לייבאַלינג באַזירט אויף פלוס ציטאָמעטרי איז געוואָרן די הויפּט מעטאָדע פֿאַר שטודירן TIL מעטאַבאָליזם. די שטודיעס האָבן געוויזן אַז קאַמפּערד מיט פּעריפערישע בלוט לימפאָציטן אָדער T סעלז פון צווייטיק לימפאָיד אָרגאַנען, האָבן מויז און מענטשלעך TIL אַ העכער טענדענץ צו אַפּטייק גלוקאָזע (4, 39) און די גראַדואַל אָנווער פון מיטאָטשאָנדריאַל פונקציע (19, 40). כאָטש מיר האָבן באמערקט ענלעכע רעזולטאַטן אין דעם לערנען, די שליסל אַנטוויקלונג איז צו פאַרגלייַכן די מעטאַבאָליזם פון טומאָר סעלז און TIL פון די זעלבע רעסעקטעד טומאָר געוועב. קאָנסיסטענט מיט עטלעכע פון ​​די פריערדיקע ריפּאָרץ, טומאָר (CD45-EpCAM +) סעלז פון אַססיטעס און טומאָרס האָבן העכער גלוקאָזע אַפּטייק ווי CD8 + און CD4 + T סעלז, שטיצן אַז די הויך גלוקאָזע אַפּטייק פון טומאָר סעלז קענען זיין קאַמפּערד מיט T סעלז. דער באַגריף פון T צעל קאַמפּעטיטשאַן. TME. אָבער, די מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט פון טומאָר סעלז איז העכער ווי די פון CD8 + T סעלז, אָבער די מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט איז ענלעך צו די פון CD4 + T סעלז. די רעזולטאַטן פארשטארקן די ימערדזשינג טעמע אַז אָקסידאַטיוו מעטאַבאָליזם איז וויכטיק פֿאַר טומאָר סעלז (41, 42). זיי פֿאָרשלאָגן אויך אַז CD8 + T צעלן זענען מעגלעך מער סאַסעפּטאַבאַל צו אָקסידאַטיוו דיספֿונקציע ווי CD4 + T צעלן, אָדער אַז CD4 + T צעלן קענען נוצן קאַרבאָן קוואלן אַנדערש ווי גלוקאָזע צו האַלטן מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט (43, 44). עס איז וויכטיק צו באַמערקן אַז מיר האָבן נישט באמערקט קיין חילוק אין גלוקאָזע אַפּטייק אָדער מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט צווישן CD4 + T עפֿעקטאָרן, T עפֿעקטאָר זכּרון און T צענטראַל זכּרון צעלן אין אַססיטעס. סימילאַרלי, די דיפערענציאַציע שטאַט פון CD8 + T צעלן אין טומאָרס האט גאָרנישט צו טאָן מיט ענדערונגען אין גלוקאָזע אַפּטייק, וואָס כיילייץ די באַטייטיק חילוק צווישן T צעלן קאַלטשערד אין וויטראָ און מענטשלעך TIL אין וויוואָ (22). די אָבסערוואַציעס זענען אויך באשטעטיקט דורך די נוצן פון אַנבייאַסט אויטאָמאַטיש צעל באַפעלקערונג אַלאַקיישאַן, וואָס ווייטער גילוי אַז CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + צעלן מיט העכער גלוקאָזע אַפּטייק און מיטאָטשאָנדריאַל טעטיקייט ווי טומאָר צעלן זענען פאַרשפּרייט אָבער האָבן מעטאַבאַליק אַקטיוו צעל באַפעלקערונג. די באַפעלקערונג קען רעפּרעזענטירן די פּוטאַטיוו סובפּאָפּולאַציע פון ​​מיעלאָיד סאַפּרעססאָר צעלן אָדער פּלאַזמאַסיטאָיד דענדריטיק צעלן יידענטיפֿייד אין די scRNA-seq אַנאַליסיס. כאָטש ביידע פון ​​די זענען געמאלדן געוואָרן אין מענטשלעכע אָווועריאַן טומאָרס [45], דאַרפן זיי נאָך ווייטערדיקע אַרבעט צו באַשרייבן די מיעלאָיד סובפּאָפּולאַציע.
כאָטש פלוס ציטאָמעטריע-באַזירטע מעטאָדן קענען קלאָר מאַכן די אַלגעמיינע אונטערשיידן אין גלוקאָזע און אָקסידאַטיוו מעטאַבאָליזם צווישן צעל טיפּן, די פּינקטלעכע מעטאַבאָליטן פּראָדוצירט דורך גלוקאָזע אָדער אַנדערע קאַרבאָן קוואלן פֿאַר מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאָליזם אין TME זענען נאָך נישט באַשטימט געוואָרן. צו באַשטימען די בייַזייַן אָדער אַוועק פון מעטאַבאָליטן צו אַ געגעבענער TIL סאַבסעט ריקווייערז רייניקונג פון דער צעל פּאָפּולאַציע פון ​​די עקסייזד געוועב. דעריבער, אונדזער צעל ענריטשמענט מעטאָד קאַמביינד מיט מאַסע ספּעקטראָמעטריע קען צושטעלן ינסייץ אין די מעטאַבאָליטן וואָס זענען דיפערענטשאַלי ענריטשט אין T סעלז און טומאָר צעל פּאָפּולאַציעס אין מאַטשינג פּאַציענט סאַמפּאַלז. כאָטש דעם מעטאָד האט אַדוואַנידזשיז איבער פלאָרעסאַנס-אַקטיווייטיד צעל סאָרטינג, זיכער מעטאַבאָליט ביבליאָטעקן קען זיין אַפעקטאַד רעכט צו ינכעראַנט פעסטקייַט און / אָדער שנעל טורנאָוווער קורס (22). דאך, אונדזער מעטאָד איז געווען ביכולת צו ידענטיפיצירן צוויי דערקענט ימיונאָסופּרעסיוו מעטאַבאָליטן, אַדענאָסינע און קינורענין, ווייַל זיי ווערייִרן זייער צווישן מוסטער טיפּן.
אונדזער מעטאַבאָנאָמישער אַנאַליז פון טומאָרן און TIL סובטיפּעס גיט מער איינבליקן אין דער ראָלע פון ​​מעטאַבאָליטן אין אָווועריאַן TME. ערשטנס, ניצן פלאָו סיטאָמעטרי, האָבן מיר באַשטימט אַז עס איז נישטאָ קיין אונטערשייד אין מיטאָטשאָנדריאַל אַקטיוויטעט צווישן טומאָרן און CD4 + T צעלן. אָבער, LC-MS/MS אַנאַליז האָט געוויזן באַדייטנדיקע ענדערונגען אין דער שעפע פון ​​מעטאַבאָליטן צווישן די פּאָפּולאַציעס, וואָס ווייַזט אַז מסקנות וועגן TIL מעטאַבאָליזם און זיין קוילעלדיק מעטאַבאָליש אַקטיוויטעט דאַרפן קערפאַל ינטערפּריטיישאַן. צווייטנס, MNA איז דער מעטאַבאָליט מיטן גרעסטן אונטערשייד צווישן CD45-צעלן און T צעלן אין אַססיטעס, נישט טומאָרן. דעריבער, קאָמפּאַרטמענטאַליזאַציע און טומאָר לאָקאַציע קען האָבן פאַרשידענע יפעקץ אויף TIL מעטאַבאָליזם, וואָס כיילייץ די מעגלעכע העטעראָגעניטי אין אַ געגעבענער מיקראָענווייראָנמענט. דריטנס, די אויסדרוק פון די MNA-פּראָדוצירנדיק ענזיים NNMT איז דער הויפּט לימיטעד צו CAF, וואָס איז טומאָר צעלן צו אַ קלענערער מאָס, אָבער דעטעקטאַבאַל MNA לעוועלס זענען באמערקט אין טומאָר-דערייווד T צעלן. די אָוווערעקספּרעסיע פון ​​NNMT אין אָווועריאַן CAF האט אַ באַקאַנט ראַק-פּראָמאָוטינג ווירקונג, טייל רעכט צו דער פּראָמאָציע פון ​​CAF מעטאַבאָליזם, טומאָר ינוואַזיע און מעטאַסטאַסיס (27). כאָטש דער אַלגעמיינער לעוועל פון TIL איז מיטלמעסיק, איז די אויסדרוק פון NNMT אין CAF ענג פֿאַרבונדן מיטן ראַק גענאָם אַטלאַס (TCGA) מעזענטשימאַל סובטיפּ, וואָס איז פֿאַרבונדן מיט אַ שלעכטער פּראָגנאָז (27, 46, 47). צום סוף, איז די אויסדרוק פון דעם ענזיים AOX1 וואָס איז פֿאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר MNA דעגראַדאַציע אויך באַגרענעצט צו דער CAF פּאָפּולאַציע, וואָס ווײַזט אָן אַז T צעלן פֿעלט די מעגלעכקייט צו מעטאַבאָליזירן MNA. די רעזולטאַטן שטיצן די געדאַנק אַז כאָטש ווײַטערדיקע אַרבעט איז נויטיק צו באַשטעטיקן דעם געפֿינס, קענען הויכע לעוועלס פון MNA אין T צעלן ווײַזן אויף דער אנוועזנהייט פֿון אַן אימונאָסאַפּרעסיווער CAF מיקראָ-סביבה.
געגעבן דעם נידעריקן אויסדרוק לעוועל פון MNA טראַנספּאָרטערס און די נישט-דעטעקטירבארע לעוועלס פון שליסל פּראָטעאינען וואָס זענען ינוואַלווד אין MNA מעטאַבאָליזאַם, איז די בייַזייַן פון MNA אין T סעלז אומגעריכט. ניט NNMT און ניט AOX1 האָבן געקענט דעטעקטירט ווערן דורך scRNA-seq אַנאַליז און טאַרגעטעד qPCR פון צוויי אומאָפּהענגיקע קאָהאָרטן. די רעזולטאַטן ווייַזן אַז MNA ווערט נישט סינטעזירט דורך T סעלז, נאָר אַבזאָרבירט פון אַרומיקע TME. אין וויטראָ עקספּערימענטן ווייַזן אַז T סעלז טענד צו אַקומולירן עקסאָגענע MNA.
אונדזערע אין וויטראָ שטודיעס האָבן געוויזן אַז עקסאָגענע MNA אינדוצירט די אויסדרוק פון TNFα אין T צעלן און פֿאַרשטאַרקט די בינדונג פון Sp1 צו די TNFα פּראָמאָטער. כאָטש TNFα האט ביידע אַנטי-טומאָר און אַנטי-טומאָר פֿונקציעס, אין אָווועריאַן ראַק, TNFα קען פּראָמאָטירן דעם וווּקס פון אָווועריאַן ראַק (31-33). די נויטראַליזאַציע פון ​​TNFα אין אָווועריאַן טומאָר צעל קולטור אָדער די עלימינאַציע פון ​​TNFα סיגנאַל אין מויז מאָדעלס קענען פֿאַרבעסערן TNFα-מעדיאַטעד ינפלאַמאַטאָרי ציטאָקין פּראָדוקציע און ינכיבאַט טומאָר וווּקס (32, 35). דעריבער, אין דעם פאַל, TME-דערייווד MNA קענען אַקט ווי אַ פּראָ-ינפלאַמאַטאָרי מעטאַבאָליט דורך אַ TNFα-אָפענגיק מעקאַניזאַם דורך די אַוטאָקרין שלייף, דערמיט פּראָמאָטירן די אויפֿטרעטן און פאַרשפּרייטונג פון אָווועריאַן ראַק (31). באַזירט אויף דעם מעגלעכקייט, TNFα בלאַקייד איז געלערנט ווי אַ פּאָטענציעל טעראַפּיוטיק אַגענט פֿאַר אָווועריאַן ראַק (37, 48, 49). אין אַדישאַן, MNA ימפּערד די ציטאָטאָקסיסיטי פון CAR-T צעלן צו אָווועריאַן טומאָר צעלן, פּראַוויידינג ווייַטער זאָגן פֿאַר MNA-מעדיאַטעד ימיון סאַפּרעשאַן. צוזאַמען, פֿאָרשלאָגן די רעזולטאַטן אַ מאָדעל אין וועלכן טומאָרן און CAF צעלן סעקרעטירן MNA אין עקסטראַסעלולאַר TME. דורך (i) TNF-ינדוסט אָווועריאַן ראַק וווּקס סטימולאַציע און (ii) MNA-ינדוסט T צעל ציטאָטאָקסיק טעטיקייט אינהיביציע, קען דאָס האָבן אַ טאָפּל טומאָר ווירקונג (פיגור 5D).
אין מסקנא, דורך אנװענדן א קאמבינאציע פון ​​שנעלער צעל-אנרייכערונג, אײנצל-צעל סיקווענסינג און מעטאבאלישער פראפיילינג, האט די שטודיע אנטפלעקט די ריזיקע אימונאמעטאבאלאמישע אונטערשיידן צווישן טומארן און אססיטעס צעלן אין HGSC פאציענטן. די קאמפרעהענסיווע אנאליז האט געוויזן אז עס זענען דא אונטערשיידן אין גלוקאז אויפנעמע און מיטאכאנדריעלער טעטיקייט צווישן T צעלן, און האט אידענטיפיצירט MNA אלס א נישט-צעל אויטאנאמישער אימונער רעגולאטורישער מעטאבאליט. די דאטן האבן אן איינפלוס אויף ווי TME אפעקטירט T צעל מעטאבאליזם אין מענטשלעכע קענסערס. כאטש די דירעקטע קאנקורענץ פאר נוטריענטן צווישן T צעלן און קענסער צעלן איז געמאלדן געווארן, קענען מעטאבאליטן אויך האנדלען אלס אומדירעקטע רעגולאטארן צו פארבעסערן טומאר פראגרעס און מעגליך אונטערדריקן ענדאגענע אימונער רעאקציעס. די װײַטערע באשרייבונג פון די פונקציאנעלע ראלע פון ​​די רעגולאטורישע מעטאבאליטן קען עפענען אלטערנאטיווע סטראטעגיעס פאר פארבעסערן די אנטי-טומאר אימונער רעאקציע.
פּאַציענט ספּעסאַמאַנז און קלינישע דאַטן זענען באַקומען דורך די BC ראַק טומאָר געוועב רעפּאָזיטאָרי סערטיפיצירט דורך די קאַנאַדיאַן טישו רעפּאָזיטאָרי נעטוואָרק. לויט דעם פּראָטאָקאָל באַשטעטיקט דורך די BC ראַק ריסערטש עטיק קאַמיטי און די אוניווערסיטעט פון בריטיש קאָלאָמביע (H07-00463), אַלע פּאַציענטן'ס ספּעסאַמאַנז און קלינישע דאַטן האָבן באַקומען אינפאָרמירטע געשריבענע צושטימונג אָדער פאָרמאַל אָפּגעזאָגט זייער צושטימונג. די מוסטערן זענען סטאָרד אין די סערטיפיצירטע ביאָבאַנק (BRC-00290). דעטאַלירטע פּאַציענט קעראַקטעריסטיקס זענען געוויזן אין טישן S1 און S5. פֿאַר קריאָפּרעזערוואַציע, אַ סקאַלפּעל ווערט גענוצט צו מעטשאַניקאַללי צעלאָזן די פּאַציענט'ס טומאָר מוסטער און דאַן שטופּן עס דורך אַ 100-מיקראָן פילטער צו באַקומען אַן איינציקע צעל סאַספּענשאַן. די פּאַציענט'ס אַססיטעס איז געווען סענטריפוגירט ביי 1500 רפּם פֿאַר 10 מינוט ביי 4°C צו פּעללעטירן די סעלז און אַראָפּנעמען די סופּערנאַטאַנט. צעלן באקומען פון טומאָר און אַססיטעס זענען קריאָפּרעזערווירט געוואָרן אין 50% היץ-אינאַקטיווירט מענטשלעך AB סערום (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) און 10% דימעטהיל סולפֿאָקסייד. די פּרעזערווירטע איינצעל צעל סאַספּענשאַנז זענען אויפגעטויט און געניצט פֿאַר מעטאַבאָלאָמיקס און מעטאַבאָליט באַשטימונג באַשריבן אונטן.
דער גאַנצער מעדיום באַשטייט פון 0.22 מיקראָמעטער פֿילטרירט 50:50 סופּלעמענטירט מיט RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-גלוטאַמין (טהערמאָ פישער סייענטיפיק) סופּלעמענטירט מיט 10% היץ-אינאַקטיוויירטע מענטשלעכע AB סערום (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (טהערמאָ פישער סייענטיפיק), 2 mM l-גלוטאַמין (טהערמאָ פישער סייענטיפיק), פישער סייענטיפיק), 1 x פּעניסיללין סטרעפּטאָמיצין (PenStrep) לייזונג (טהערמאָ פישער סייענטיפיק) און 50 μMB-מערקאַפּטאָעטאַנאָל. AimV (אינוויטראָגען) איז סופּלעמענטירט מיט 20 mM Hepes (טהערמאָ פישער סייענטיפיק) און 2 mM l-גלוטאַמין (טהערמאָ פישער סייענטיפיק). דער פֿלוס ציטאָמעטער פֿאַרבונג באַפֿער האָט באַשטאַנען פֿון 0.22μm פֿילטרירט פֿאָספֿאַט באַפֿערד סאַלין (PBS; Invitrogen) סופּלעמענטירט מיט 3% היץ-אינאַקטיוויירטע AB מענטשלעכע סערום (Sigma). דער צעל-אנרייַכערונג באַפער איז צוזאַמענגעשטעלט פון 0.22μm פֿילטרירט PBS און סופּלעמענטירט מיט 0.5% היץ-אינאַקטיוויירט מענטשלעך AB סערום (סיגמאַ-אַלדריטש).
אין 37°C גאַנצן מעדיום, זענען די צעלן געפֿאַרבט געוואָרן מיט 10 nM MT DR און 100 μM 2-NBDG פֿאַר 30 מינוט. דערנאָך זענען די צעלן געפֿאַרבט געוואָרן מיט ווייאַביליטי דיי eF506 ביי 4°C פֿאַר 15 מינוט. סוספּענדירט די צעלן אין FC Block (eBioscience) און Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), פֿאַרדיןנט אין פֿלוס ציטאָמעטער סטיינינג באַפֿער (לויט די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט), און אינקובירט פֿאַר 10 מינוט ביי צימער טעמפּעראַטור. פֿאַרבט די צעלן מיט אַ סעט אַנטיקערפּערס (טאַבעלע S2) אין פֿלוס ציטאָמעטרי סטיינינג באַפֿער ביי 4°C פֿאַר 20 מינוט. סוספּענדירט די צעלן אין פֿלוס ציטאָמעטרי סטיינינג באַפֿער (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R קאָנפֿיגוראַציע) פֿאַר אַנאַליז. ניצט SpectroFlo און FlowJo V10 צו אַנאַליזירן צעל צייל דאַטן, און ניצט GraphPad Prism 8 צו שאַפֿן די דאַטן. די מעדיאַן פלואָרעסענס אינטענסיטעט (MFI) פון 2-NBDG און MT DR איז געווען לאָג-נאָרמאַליזירט, און דערנאָך איז אַ פּערד ט טעסט געניצט געוואָרן פֿאַר סטאַטיסטישע אַנאַליז צו רעכענען פֿאַר פּאַסיקע פּאַציענטן. אַראָפּנעמען אַלע פּאָפּולאַציעס מיט ווייניקער ווי 40 געשעענישן פֿון דער אַנאַליז; אַרייַן אַן MFI ווערט פֿון 1 פֿאַר קיין נעגאַטיווע ווערטן איידער דורכפֿירן סטאַטיסטישע אַנאַליז און דאַטן וויזואַליזאַציע.
כּדי צו דערגאַנצן די מאַנועלע גייטינג סטראַטעגיע פֿון דעם אויבן דערמאָנטן פּראָצעס פּאַנעל, האָבן מיר גענוצט די פֿולע אַנאָטאַציע דורך דעם פֿאָרעם ריסטריקשאַן בוים (FAUST) (21) צו אויטאָמאַטיש צוטיילן צעלן צו דער פּאָפּולאַציע נאָך עלימינירן טויטע צעלן אין FlowJo. מיר פירן מאַנועל די רעזולטאַטן צו פֿאַראייניקן פּאָפּולאַציעס וואָס שיינען צו זיין פֿאַלש צוגעטיילט (קאָמבינירן PD1+ מיט PD1-טומאָר צעלן) און באַהאַלטענע פּאָפּולאַציעס. יעדער מוסטער כּולל אַ דורכשניט פֿון מער ווי 2% צעלן, פֿאַר אַ סך־הכּל פֿון 11 פּאָפּולאַציעס.
פיקאָל גראַדיענט געדיכטקייט צענטריפוגאַציע איז גענוצט געוואָרן צו צעשיידן PBMC פֿון לויקאָציט צעשיידונג פּראָדוקטן (STEMCELL טעכנאָלאָגיעס). CD8 + T צעלן זענען אפגעזונדערט געוואָרן פֿון PBMC מיט CD8 מיקראָבעאַדס (Miltenyi) און אויסגעברייטערט אין גאַנצן מעדיום מיט TransAct (Miltenyi) פֿאַר 2 וואָכן לויט די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט. די צעלן זענען געלאָזט געוואָרן שטיין פֿאַר 5 טעג אין גאַנצן מעדיום מיט IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), און דערנאָך ווידער-סטימולירט מיט TransAct. אויף טאָג 7, לויט די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט, זענען מענטשלעכע CD45 מיקראָבעאַדס (Miltenyi) גענוצט געוואָרן צו באַרייַכערן צעלן אין דריי קאָנסעקוטיווע ראָונדס. די צעלן זענען אַליקוואָטירט געוואָרן פֿאַר פֿלוס סיטאָמעטרי אַנאַליז (ווי באַשריבן אויבן), און איין מיליאָן צעלן זענען אַליקוואָטירט געוואָרן דריי מאָל פֿאַר LC-MS/MS אַנאַליז. די מוסטערן זענען פּראַסעסט געוואָרן דורך LC-MS/MS ווי באַשריבן אונטן. מיר האָבן געשאַצט דעם פֿעלנדיקן מעטאַבאָליט ווערט מיט אַן יאָן נומער פֿון 1,000. יעדער מוסטער ווערט נאָרמאַליזירט לויט דער גאַנצער יאָן נומער (TIC), לאָגאַריטמיש קאָנווערטירט און אויטאָמאַטיש נאָרמאַליזירט אין MetaboAnalystR איידער אַנאַליז.
די איינציקע צעל סאַספּענשאַן פון יעדן פּאַציענט איז געוואָרן אויפגעטאָט און געפילטערט דורך אַ 40 μm פילטער אין אַ גאַנצן מעדיום (ווי באַשריבן אויבן). לויטן פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט, זענען דריי קאָנסעקוטיווע רונדעס פון פּאָזיטיווע סעלעקציע דורך מאַגנעטישע בעדל צעשיידונג מיט מיקראָבעדס (מילטעני) גענוצט געוואָרן צו באַרייכערן די מוסטערן פֿאַר CD8+, CD4+ און CD45- צעלן (אויף אייז). אין קורצן, די צעלן ווערן ווידער-סוספּענדירט אין צעל באַרייכערונג באַפער (ווי באַשריבן אויבן) און געציילט. די צעלן זענען אינקובירט געוואָרן מיט מענטשלעכע CD8 בעדל, מענטשלעכע CD4 בעדל אָדער מענטשלעכע CD45 בעדל (מילטעני) ביי 4°C פֿאַר 15 מינוט, און דערנאָך געוואַשן מיט צעל באַרייכערונג באַפער. דער מוסטער ווערט דורכגעפֿירט דורך דער LS קאָלום (מילטעני), און די פּאָזיטיווע און נעגאַטיווע פראַקציעס ווערן געזאַמלט. כּדי צו רעדוצירן די געדויער און מאַקסאַמיזירן דעם צעל אָפּזוך שריט, ווערט די CD8-פראַקציע דערנאָך גענוצט פֿאַר דער צווייטער רונדע פֿון CD4+ באַרייכערונג, און די CD4-פראַקציע ווערט גענוצט פֿאַר דער ווייטערדיקער CD45-באַרייכערונג. האַלט די לייזונג אויף אייז איבערן גאַנצן צעשיידונג פּראָצעס.
כדי צו צוגרייטן מוסטערן פאר מעטאבאליט אנאליז, זענען די צעלן געוואשן געווארן איין מאל מיט א אייז-קאלטן זאלץ לייזונג, און 1 מל פון 80% מעטאנאל איז צוגעגעבן געווארן צו יעדן מוסטער, דערנאך געווארטעקסט און שנעל איינגעפרארן אין פליסיגן שטיקשטאף. די מוסטערן זענען אונטערגעווארפן געווארן צו דריי איינפרירן-אויפטויען ציקלען און צענטריפוגירט ביי 14,000 רפּם פאר 15 מינוט ביי 4°C. דער איבערוואסער וואס אנטהאלט די מעטאבאליטן איז פארדאמפט ביז טרוקן. די מעטאבאליטן זענען ווידער אויפגעלייזט געווארן אין 50 μl פון 0.03% פאָרמיש זויער, געווארטעקסט צו מישן, און דערנאך צענטריפוגירט צו באזייטיגן דעבריס.
עקסטראַקטירן מעטאַבאָליטן ווי באַשריבן אויבן. טראַנספערירן דעם סופּערנאַטאַנט צו אַ הויך-פּערפאָרמאַנס פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע פלאַש פֿאַר מעטאַבאָלאָמיקס פאָרשונג. ניצן אַ ראַנדאָם באַהאַנדלונג פּראָטאָקאָל צו באַהאַנדלען יעדן מוסטער מיט אַ ענלעכער צאָל צעלן צו פאַרמייַדן באַטש יפעקץ. מיר האָבן דורכגעפירט אַ קוואַליטאַטיווע אַסעסמאַנט פון גלאָבאַלע מעטאַבאָליטן פריער ארויסגעגעבן אויף די AB SCIEX QTRAP 5500 טריפּל קוואַדרופּאָל מאַסע ספּעקטראָמעטער (50). כראָמאַטאָגראַפֿישע אַנאַליז און שפּיץ שטח אינטעגראַציע זענען דורכגעפירט געוואָרן מיט MultiQuant ווערסיע 2.1 ווייכווארג (Applied Biosystems SCIEX).
אן יאן צייל פון 1000 איז גענוצט געווארן צו שאצן דעם פעלנדיקן מעטאבאליט ווערט, און די TIC פון יעדן מוסטער איז גענוצט געווארן צו רעכענען די נארמאליזירטע שפיץ שטח פון יעדן דעטעקטירטן מעטאבאליט צו קארעקטירן פאר ענדערונגען איינגעפירט דורך די אינסטרומענטאלע אנאליז פון מוסטער פראצעסירונג. נאכדעם וואס TIC איז נארמאליזירט, ווערט MetaboAnalystR(51) (דעפאלט פאראמעטער) גענוצט פאר לאגאריטמישע קאנווערזיע און אויטאמאטישע נארם ליניע סקאלירונג. מיר האבן גענוצט PCA מיט וועגאן R פעקל צו דורכפירן עקספלאראטאריע אנאליז פון מעטאבאלאם אונטערשיידן צווישן מוסטער טיפן, און גענוצט טיילווייזע רעדאנדאנס אנאליז צו אנאליזירן פאציענטן. מיר האבן גענוצט ווארד מעטאד צו קאנסטרואירן א היץ מאפע דענדראגראם צו קלאסטערן די עוקלידישע דיסטאנץ צווישן מוסטערן. מיר האבן גענוצט לימא (52) אויף סטאנדארדיזירטע מעטאבאליט שעפע צו אידענטיפיצירן דיפערענציעל שעפעדיקע מעטאבאליטן איבער דעם גאנצן צעל טיפ און מיקרא-אומגעבונג. כדי צו פארפּשוטערן די דערקלערונג, נוצן מיר דעם גרופע דורכשניט פאראמעטער צו ספעציפיצירן דעם מאדעל, און באטראכטן די צעל טיפן אין דער מיקרא-אומגעבונג ווי יעדע גרופע (n = 6 גרופעס); פארן באדייטונגס-טעסט, האבן מיר דורכגעפירט דריי איבערגעחזרטע מעסטונגען פאר יעדן מעטאבאליט. כדי צו פארמיידן פאלשע רעפליקאציע, איז דער פאציענט אריינגענומען געווארן אלס א שטערונג אין דעם לימא-דיזיין. כדי צו קאנטראלירן די אונטערשיידן אין מעטאבאליטן צווישן פארשידענע פאציענטן, האבן מיר צוגעפאסט דעם לימא-מאדעל ארייננעמענדיג פאציענטן אויף א פעסטן וועג. מיר באריכטן די באדייטונג פון דעם פאר-באשטימטן קאנטראסט צווישן דעם צעל-טיפ און דער מיקרא-אומגעבונג פון פאדזש <0.05 (בענזשאמיני-האכבערג קארעקציע).
נאך קראַפט-אנרייכערונג מיטן נוצן Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% לעבנס-פעאיקייט), איז איינצל-צעל טראַנסקריפּטאָם סיקווענסינג דורכגעפירט געוואָרן אויף די גאַנצע לעבעדיקע פאַרפרוירענע אַססיטעס און טומאָר מוסטערן מיטן נוצן אַ 10x 5′גענע אויסדרוק פּראָטאָקאָל. פינף פאַלן מיט פּאַסיקע טומאָרן און אַססיטעס זענען אַנאַליזירט געוואָרן, כאָטש די נידעריקע לעבנס-פעאיקייט פון איין טומאָר מוסטער האָט פאַרהיטן זיין איינשליסונג. כּדי צו דערגרייכן קייפל סעלעקציעס פון פּאַציענטן, האָבן מיר קאָמבינירט די מוסטערן פון יעדן פּאַציענט אין די ליניעס פון די 10x קראָום קאָנטראָללער, און אַנאַליזירט די אַססיטעס און טומאָר זייטלעך באַזונדער. נאך סיקווענסינג [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp פּערד ענד (PE), קוועבעק גענאָם; א דורכשניט פון 73,488 און 41,378 לייענונגען פּער צעל פֿאַר טומאָר און אַססיטעס ריספּעקטיוולי]], מיר האָבן גענוצט CellSNP און Vireo (53) (באַזירט אויף CellSNP ווי דער געוויינטלעכער מענטשלעכער SNP (VCF) צוגעשטעלט דורך GRCh38 איז אַסיינד אַ דאָנאָר אידענטיטעט. מיר נוצן SNPRelate צו אויסרעכענען די קלאָוסאַסט אידענטיטעט (IBS) פון דעם פּאַציענט'ס גענאָטיפּ סטאַטוס (IBS), אַחוץ נישט-אַסיינד סעלז און סעלז אידענטיפיצירט ווי דופּלעקסעס און מאַטשינג דאָנאָרס צווישן אַססיטעס און טומאָר סאַמפּאַלז (54). אויף דער באַזע פון ​​דעם אַרבעט, מיר האָבן ריטיינד דרייַ קאַסעס מיט שעפעדיק צעל רעפּרעזענטאַציע אין די טומאָר און אַססיטעס פֿאַר דאַונסטרים אַנאַליסיס. נאָך דורכפירן אַ מאַסע פילטריישאַן שריט אין די סקאַטער (55) און סקראַן (56) ביאָקאָנדוקטאָר פּאַקקאַגינג, דאָס האט געגעבן 6975 סעלז (2792 און 4183 סעלז פון טומאָר און אַססיטעס, ריספּעקטיוולי) פֿאַר אַנאַליסיס. מיר נוצן igraph's (57) Louvain קלאַסטערינג פון שערד נעאַסט שכנים נעטוואָרק (SNN) באַזירט אויף דזשאַקאַרד דיסטאַנסע צו קלאַסטער סעלז דורך אויסדרוק. די קלאַסטערס זענען מאַנועל אַנאָטירט געוואָרן צו מעגלעכע צעל טיפּן באַזירט אויף מאַרקער דזשין אויסדרוק און וויזואַליזירט מיט t-SNE. ציטאָטאָקסישע T צעלן ווערן דעפינירט דורך די אויסדרוק פון CD8A און GZMA, אַחוץ סובקלאַסטערס מיט נידעריק ריבאָסאָמאַל פּראָטעין אויסדרוק. מיר האָבן אַקסעסט די פאַרעפֿנטלעכטע דאַטן פון איזאַר עט על. (16), אַרייַנגערעכנט זייער t-SNE עמבעדינג, וואָס קען קאָנטראָלירן די אויסדרוק אָוווערלאַפּ צווישן ימיון צעל מאַרקערס און NNMT אויסדרוק.
PBMC זענען אפגעזונדערט געווארן פון לויקאציט אפזונדערונג פראדוקטן (STEMCELL טעקנאַלאַדזשיז) דורך פיקאָל גראַדיענט געדיכטקייט צענטריפוגאַציע. CD3+ צעלן זענען אפגעזונדערט געווארן פון PBMC ניצנדיק CD3 קרעלן (Miltenyi). אין דער אנוועזנהייט אדער אָפּוועזנהייט פון MNA, CD3+ צעלן זענען אַקטיוויזירט געווארן מיט פּלאַטע-געבונדן CD3 (5μg/ml), סאַליאַבאַל CD28 (3μg/ml) און IL-2 (300 U/ml; פּראָלויקין). אויף דעם לעצטן טאָג פון יקספּאַנשאַן, די ווייאַביליטי (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) און פּראָליפעריישאַן (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) זענען עוואַלויִרט געווארן דורך פלאָו סיטאָמעטרי. עוואַלויִרט עפֿעקטאָר פֿונקציע דורך סטימולירן צעלן מיט PMA (20 ng/ml) און יאָנאָמיצין (1μg/ml) מיט GolgiStop פֿאַר 4 שעה, און מאָניטאָר CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) און TNFα-פֿלואָרעסצעין איזאָטהיאָסיאַנאַט (FITC) (MAb11, BD). סטימולירט qPCR און ChIP צעלן מיט PMA (20 ng/ml) און יאָנאָמיצין (1μg/ml) פֿאַר 4 שעה. דער ELISA סופּערנאַטאַנט איז געזאַמלט געוואָרן פֿאַר און נאָך סטימולאַציע מיט PMA (20 ng/ml) און יאָנאָמיצין (1 μg/ml) פֿאַר 4 שעה.
פֿאָלגט דעם פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט צו איזאָלירן RNA ניצנדיק RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). ניצט QIAshredder (QIAGEN) צו האָמאָגעניזירן דעם מוסטער. ניצט אַ הויך-קאַפּאַציטעט RNA צו cDNA קיט (Thermo Fisher Scientific) צו סינטעזירן קאָמפּלעמענטאַרע DNA (cDNA). ניצט TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) צו קוואַנטיפֿיצירן גענע אויסדרוק (לויטן פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט) מיט די פֿאָלגנדיקע פּראָובס: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [גליסעראַלדעהייד-3-פאָספאַט אָף הידראָגען (GAPDH)] און Hs01010726_m1 (SLC22A2). די מוסטערן זענען געלאפן אויף די StepOnePlus רעאל-צייט PCR סיסטעם (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) אין די MicroAmp שנעלע אפטישע 96-וועלל רעאקציע טעלער (Applied Biosystems) מיט MicroAmp אפטישע פילם. יעדער Ct ווערט וואס איז העכער 35 ווערט באטראכט אלס העכער די דעטעקציע שוועל און ווערט באצייכנט אלס נישט דעטעקטירבאר.
דורכפירן ChIP ווי פריער באשריבן (58). אין קורצן, די צעלן זענען באהאנדלט געווארן מיט פארמאלדעהייד (לעצט קאנצענטראציע 1.42%) און אינקובירט ביי צימער טעמפעראטור פאר 10 מינוט. ניצן סופלېמענטירטן שוועלונג באַפער (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl און 0.1% NP-40) אויף אייז פאר 10 מינוט, דערנאך איבער-סוספּענדירן אין אימונאָפּרעסיפּיטאַציע באַפער ווי באשריבן (58). די מוסטער איז דערנאך סאָניקירט געווארן מיט די פאלגענדע ציקלען: 10 ציקלען (20 1-סעקונדע פּולסן) און א סטאַטישע צייט פון 40 סעקונדעס. אינקובירן ChIP-גראַד אימונאָגלאָבולין G (Cell Signaling Technology; 1μl), היסטאָן H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) און SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) אַנטיקערפּערס מיט די מוסטער ביי 4°CC און שאָקלען איבערנאכט. אינקובירט פּראָטעין A קרעלן (טהערמאָ פישער סייענטיפיק) מיטן מוסטער ביי 4°C מיט לייכטן שאקלען פאר 1 שעה, דערנאך ניצט טשעלעקס קרעלן (ביאָ-ראַד) צו באַרייכערן די דנאַ, און ניצט פּראָטעינאַזע K (טהערמאָ פישער) פאר פּראָטעין פארדייאונג. TNFα פּראָמאָטער איז דעטעקטירט געוואָרן דורך PCR: פאָרווערטס, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; פאַרקערט, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp פּראָדוקט). די בילדער זענען פּראָדוצירט געוואָרן דורך Image Lab (ביאָ-ראַד) און קוואַנטיפיצירט מיט ImageJ ווייכווארג.
דער צעל קולטור סופּערנאַטאַנט איז געזאמלט געוואָרן ווי באַשריבן אויבן. די באַשטימונג איז דורכגעפירט געוואָרן לויט די פאַבריקאַנט'ס פּראָצעדורן פון מענטשלעכן TNFα ELISA קיט (Invitrogen), מענטשלעכן IL-2 ELISA קיט (Invitrogen) און מענטשלעכן IFN-γ ELISA קיט (Abcam). לויטן פאַבריקאַנט'ס פּראָטאָקאָל, איז דער סופּערנאַטאַנט פארדיןנט געוואָרן 1:100 צו דעטעקטירן TNFα און IL-2, און 1:3 צו דעטעקטירן IFN-γ. ניצט EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) צו מעסטן אַבסאָרבאַנס ביי 450 נם.
PBMC זענען אפגעזונדערט געווארן פון לויקאציט אפזונדערונג פראדוקטן (STEMCELL טעקנאַלאַדזשיז) דורך פיקאָל גראַדיענט געדיכטקייט צענטריפוגאַציע. CD3+ צעלן זענען אפגעזונדערט געווארן פון PBMC ניצנדיק CD3 קרעלן (Miltenyi). אין דער אנוועזנהייט אדער אָפּוועזנהייט פון MNA, CD3+ צעלן זענען אַקטיוויזירט געווארן מיט פּלאַטע-געבונדן CD3 (5μg/ml), סאַליאַבאַל CD28 (3μg/ml) און IL-2 (300 U/ml; פּראָלוקין) פאר 3 טעג. נאך 3 טעג, די צעלן זענען געזאמלט געווארן און געוואשן מיט 0.9% סאַלין, און די פּעלעט איז געווען שנעל-געפראָרן. צעל ציילן איז דורכגעפירט געווארן דורך פלאָו סיטאָמעטרי (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R קאָנפיגוראַציע) ניצנדיק 123count eBeads.
עקסטראַקט מעטאַבאָליטן ווי באַשריבן אויבן. דער טרוקענער עקסטראַקט איז רעקאָנסטיטויִרט געוואָרן ביי אַ קאָנצענטראַציע פון ​​4000 צעל עקוויוואַלענטן/μl. אַנאַליזירט דעם מוסטער דורך ריווערסט-פאַסע כראָמאַטאָגראַפֿיע (1290 Infinity II, Agilent Technologies, סאַנטאַ קלאַראַ, CA) און CORTECS T3 קאָלום (2.1×150 מם, פּאַרטיקל גרייס 1.6-μm, פּאָרע גרייס 120-Å; #186008500, וואָטערס). פּאָלאַר מאַסע ספּעקטראָמעטער (6470, Agilent), אין וועלכן עלעקטראָספּריי ייאַניזאַציע אַרבעט אין פּאָזיטיוון מאָדע. מאָביל פאַסע A איז 0.1% פאָרמיק זויער (אין H2O), מאָביל פאַסע B איז 90% אַצעטאָניטריל, 0.1% פאָרמיק זויער. דער LC גראַדיענט איז 0 ביז 2 מינוט פֿאַר 100% A, 2 ביז 7.1 מינוט פֿאַר 99% B, און 7.1 ביז 8 מינוט פֿאַר 99% B. דערנאָך, גלייכגעוויכט ווידער די קאָלום מיט מאָבילער פאַזע A מיט אַ פֿלוס ראַטע פֿון 0.6 מל/מינוט פֿאַר 3 מינוט. דער פֿלוס ראַטע איז 0.4 מל/מינוט, און די קאָלום קאַמער ווערט געהייצט צו 50°C. ניצט MNA'ס ריין כעמישער סטאַנדאַרט (M320995, טאָראָנטאָ ריסערטש כעמישער קאָמפּאַני, נאָרט יאָרק, אָנטאַריאָ, קאַנאַדע) צו באַשטעטיקן ריטענשאַן צייט (RT) און טראַנספֿאָרמאַציע (RT = 0.882 מינוט, טראַנספֿאָרמאַציע 1 = 137→94.1, טראַנספֿאָרמאַציע 2 = 137→92, קאָנווערסיע 3 = 137→78). ווען אַלע דריי טראַנזישאַנז פּאַסירן אין דער ריכטיקער ריטענשאַן צייט, ווערט טראַנזישאַן 1 געניצט פֿאַר קוואַנטיפֿיקאַציע צו ענשור ספּעציפֿישקייט. די סטאַנדאַרט קורווע פון ​​MNA (טאָראָנטאָ ריסערטש כעמישער קאָמפּאַני) איז גענערירט געוואָרן דורך זעקס סעריעלע דיילושאַנז פון דער סטאַק לייזונג (1 מג/מל) צו באַקומען סטאַנדאַרדן פון 0.1, 1.0, 10 און 100 נג/מל און 1.0 און 10μg/מל ריספּעקטיוולי פליסיק. די דעטעקציע לימיט איז 1 נג/מל, און די לינעאַרע רעאַקציע איז צווישן 10 נג/מל און 10μg/מל. יעדע אינדזשעקציע פון ​​צוויי מיקראָליטער פון מוסטער און סטאַנדאַרט ווערט גענוצט פֿאַר LC/MS אַנאַליז, און אַ געמישט קוואַליטעט קאָנטראָל מוסטער ווערט דורכגעפירט יעדע אַכט אינדזשעקשאַנז צו ענשור די סטאַביליטעט פון דער אַנאַליז פּלאַטפאָרמע. די MNA רעאַקציעס פון אַלע MNA-באַהאַנדלטע צעל מוסטערן זענען געווען אין די לינעאַרע קייט פון די אַסיי. דאַטן אַנאַליז איז געטאָן מיט MassHunter קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליז ווייכווארג (v9.0, Agilent).
די צווייטע דור αFR-CAR קאנסטרוקט איז גענומען פון סאנג און אנדערע (59). אין קורצן, די קאנסטרוקט אנטהאלט די פאלגנדע אינהאלט: CD8a לידער סיקווענס, מענטשלעכע αFR-ספעציפישע איין-קייט וועריאַבלע פראַגמענט, CD8a הינגע און טראַנסמעמבראַנע געגנט, CD27 אינטראַצעלולאַר דאָמעין און CD3z אינטראַצעלולאַר דאָמעין. די גאַנצע CAR סיקווענס איז סינטעזירט געוואָרן דורך GenScript, און דערנאָך קלאָנירט אין די צווייטע-דור לענטיוויראַל אויסדרוק וועקטאָר אַפּסטרים פון די GFP אויסדרוק קאַסעטע געניצט צו עוואַלויִרן די טראַנסדוקציע עפעקטיווקייט.
לענטיווירוס ווערט פראדוצירט דורך טראנספעקציע פון ​​HEK293T צעלן [אמעריקאנער טיפ קולטור קאלעקשאן (ATCC); געוואקסן אין דולבעקקא'ס מאדיפיצירטע איגל מעדיום מיט 10% פעטאלע רינדער סערום (FBS) און 1% פענסטרעפּ, און גענוצט CAR-GFP וועקטאָר און די פּאַקאַדזשינג פּלאַזמידן (psPAX2 און pMD2.G, Addgene) נוצן ליפּאָפעקציע אַמין (Sigma-Aldrich). דער ווירוס-אנטהאלטנדיקער סופּערנאַטאַנט איז געזאמלט געוואָרן 48 און 72 שעה נאָך טראנספעקציע, געפילטערט, און קאָנצענטרירט דורך אולטראַצענטריפוגאַציע. האַלטן דעם קאָנצענטרירטן וויראַלן סופּערנאַטאַנט ביי -80°C ביז טראַנסדוקציע.
PBMC ווערן אפגעזונדערט פון געזונטע דאָנאָר לויקאָציט צעשיידונג פּראָדוקטן (STEMCELL טעכנאָלאָגיעס) דורך Ficoll גראַדיענט געדיכטקייט צענטריפוגאַציע. ניצט positive selection CD8 מיקראָבעאַדס (Miltenyi) צו אפגעזונדערן CD8+ צעלן פון PBMC. סטימולירן T צעלן מיט TransAct (Miltenyi) און אין TexMACS מעדיום [Miltenyi; סופּלעמענטירט מיט 3% היץ-אינאַקטיוויייטיד מענטשלעך סערום, 1% PenStrep און IL-2 (300 U/ml)]. פיר און צוואַנציק שעה נאָך סטימולאַציע, T צעלן זענען טראַנסדוסירט מיט לענטיווירוס (10 μl קאַנסאַנטרייטאַד ווירוס סופּערנאַטאַנט פּער 106 צעלן). 1 ביז 3 טעג נאָך טראַנסדוקציע אויף Cytek Aurora (אויף FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), עוואַלויִרט די GFP אויסדרוק פון די צעלן צו דעמאָנסטרירן אַ טראַנסדוקציע עפעקטיווקייט פון לפּחות 30%.
CAR-T צעלן זענען קולטיווירט געוואָרן פֿאַר 24 שעה אין Immunocult (STEMCELL Technologies; סופּלעמענטירט מיט 1% PenStrep) אונטער די פֿאָלגנדיקע באַדינגונגען: נישט באַהאַנדלט, באַהאַנדלט מיט 250 μM אַדענאָסין אָדער 10 mM MNA. נאָך פֿאָרבאַהאַנדלונג, זענען CAR-T צעלן געוואַשן געוואָרן מיט PBS און קאָמבינירט מיט 20,000 SK-OV-3 צעלן [ATCC; אין McCoy 5A מעדיום (Sigma-Aldrich) סופּלעמענטירט מיט 10% FBS און 1% PenStrep ביי 10: די עפֿעקטאָר צו ציל פאַרהעלטעניש פֿון 1 איז אַמפּליפֿיצירט געוואָרן אין טריפּליקאַט אין סופּלעמענטירט Immunocult מעדיום. SK-OV-3 צעלן און SK-OV-3 צעלן ליזירט מיט דידזשאַטאַליס סאַפּאָנין (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) זענען געניצט געוואָרן ווי נעגאַטיווע און פּאָזיטיווע קאָנטראָלן, ריספּעקטיוולי. נאָך 24 שעה פֿון קאָ-קולטיוואַציע, איז דער סופּערנאַטאַנט געזאַמלט געוואָרן און די לאַקטאַט דעהידראָגענאַזע (LDH) איז געמאָסטן געוואָרן לויט די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). דער LDH סופּערנאַטאַנט איז געווען דיילוטאַד 1:50 אין LDH באַפער. דער פּראָצענט פון טויטן איז געמאָסטן מיט דער פאלגענדער פאָרמולע: פּראָצענט פון טויטן = פּראָצענט פון קערעקשאַן / מאַקסימום טויטן קורס x 100%, וואו פּראָצענט פון קערעקשאַן = קאָ-קולטור-נאָר T צעלן, און מאַקסימום טויטן קורס = פּאָזיטיוו קאָנטראָל-נעגאַטיוו קאָנטראָל.
ווי באשריבן אין דעם טעקסט אדער מאַטעריאַלן און מעטאָדן, ניצט GraphPad Prism 8, Microsoft Excel אדער R v3.6.0 פֿאַר סטאַטיסטישע אַנאַליז. אויב קייפל מוסטערן ווערן געזאַמלט פֿון דעם זעלבן פּאַציענט (אַזאַ ווי אַססיטעס און טומאָר), ניצן מיר אַ פּערד ט טעסט אָדער אַרייַננעמען דעם פּאַציענט ווי אַ ראַנדאָם ווירקונג אין אַ לינעאַר אָדער גענעראַליזירט מאָדעל ווי פּאַסיק. פֿאַר מעטאַבאַלאָמיקס אַנאַליז, ווערט דער וויכטיקייט טעסט דורכגעפֿירט אין טריפּליקאַט.
פֿאַר נאָך מאַטעריאַלן פֿאַר דעם אַרטיקל, ביטע זען http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
דאָס איז אַן אָפֿן אַקסעס אַרטיקל פֿאַרשפּרייט אונטער די באַדינגונגען פֿון דער Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, וואָס ערלויבט די נוצן, פֿאַרשפּרייטונג און רעפּראָדוקציע אין יעדן מעדיום, ווי לאַנג ווי די לעצטע נוצן איז נישט פֿאַר קאמערציעלע געווינס און די פּרעמיס איז אַז די אָריגינעלע אַרבעט איז ריכטיק. רעפֿערענץ.
נאטיץ: מיר בעטן אייך נאר צו געבן אייער בליצפּאָסט אַדרעס, אַזוי אַז דער מענטש וואָס איר רעקאָמענדירט צו דער בלאַט זאָל וויסן אַז איר ווילט אַז זיי זאָלן זען דעם בליצפּאָסט און אַז עס איז נישט ספּאַם. מיר וועלן נישט כאַפּן קיין בליצפּאָסט אַדרעסן.
די פראגע ווערט גענוצט צו טעסטן צי איר זענט א באזוכער און צו פארמיידן אויטאמאטישע ספאם אריינשיקונג.
מאַריס קיי קילגאָור (מאַריסאַ קיי קילגאָור), שרה מאַקפערסאָן (שרה מאַקפערסאָן), לאָראַן ג. זאַטשאַריאַס (לאָראַן ג. זאַטשאַריאַס), אַביגאַיל עלי אַריס ג. וואַצאָן (ה. וואַצאָן), יוחנן סטאַגג (יוחנן סטאַג), בראַד ה. נעלסאָן (בראַד ה. נעלסאָן), ראַלף דזש. דע בעלאַרדיני (ראַלף דזשאָנעס דזש.), רוססעלל ג. פינעאַס טי האַמילטאָן (פינעאַס טי.
MNA ביישטייערט צו דער אימונער סאַפּרעשאַן פון ט צעלן און רעפּרעזענטירט אַ פּאָטענציעל אימונאָטהעראַפּי ציל פֿאַר דער באַהאַנדלונג פון מענטשלעכן ראַק.
מאַריס קיי קילגאָור (מאַריסאַ קיי קילגאָור), שרה מאַקפערסאָן (שרה מאַקפערסאָן), לאָראַן ג. זאַטשאַריאַס (לאָראַן ג. זאַטשאַריאַס), אַביגאַיל עלי אַריס ג. וואַצאָן (ה. וואַצאָן), יוחנן סטאַגג (יוחנן סטאַג), בראַד ה. נעלסאָן (בראַד ה. נעלסאָן), ראַלף דזש. דע בעלאַרדיני (ראַלף דזשאָנעס דזש.), רוססעלל ג. פינעאַס טי האַמילטאָן (פינעאַס טי.
MNA ביישטייערט צו דער אימונער סאַפּרעשאַן פון ט צעלן און רעפּרעזענטירט אַ פּאָטענציעל אימונאָטהעראַפּי ציל פֿאַר דער באַהאַנדלונג פון מענטשלעכן ראַק.
©2021 אמעריקאנער אַססאָסיאַטיאָן פֿאַר די אַדוואַנסמאַנט פון וויסנשאַפֿט. אַלע רעכט רעזערווירט. AAAS איז אַ שוטעף פון HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef און COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.