א דאנק פארן באזוכן Nature.com. די בראַוזער ווערסיע וואָס איר ניצט האט באַגרענעצטע שטיצע פֿאַר CSS. פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר ניצט אַן דערהייַנטיקטן בראַוזער (אָדער דיאַקטיווירן קאָמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). אין דער דערווייל, צו ענשור קאַנטיניואַס שטיצע, וועלן מיר ווייַזן די וועבזייטל אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
אנדערש ווי ווערטעבראטן, ווערט ברייט געמיינט אז אינסעקטן האבן נישט קיין זכר-פארצויגענע סעקס סטערויד הארמאנען. אין אנאפעלעס גאמביע, שיינט עס אז דער עקדיסאן סטערויד 20-הידראקסיעקדיסאן (20E) האט זיך אנטוויקלט צו קאנטראלירן איי אנטוויקלונג ווען סינטעזירט דורך די נקבות2 און צו אינדוצירן א פארפארונגס-רעפראקטארישע פעריאד ווען סעקסועל טראנספערירט דורך זכר3. ווייל איי אנטוויקלונג און פארפארונג זענען וויכטיגע רעפראדוקטיווע אייגנשאפטן, קען פארשטיין ווי די נקבות אנאפעלעס מוסקיטאס אינטעגרירן די הארמאנאלע סיגנאלן פארלייכטערן דעם פלאן פון נייע מאלאריע קאנטראל פראגראמען. דא, אנטפלעקן מיר אז די רעפראדוקטיווע פונקציעס ווערן רעגולירט דורך באזונדערע סעקס סטערוידן דורך א קאמפלעקסע נעץ פון עקדיסטערויד-אקטיווירנדיקע/אינאקטיווירנדיקע ענזימען. מיר האבן אידענטיפיצירט א זכר-ספעציפישן אקסידירטן עקדיסאן, 3-דעהידרא-20E (3D20E), וואס באשיצט די עלטערן-שאפט דורך אפשטעלן די נקבות'ישע סעקסועלע רעצעפטיוויטעט נאך סעקסועלע טראנספער און אקטיוואציע דורך דעפאספארילאציע. באמערקענסווערט, 3D20E טראנספער האט אויך אינדוצירט די אויסדרוק פון רעפראדוקטיווע גענעס וואס האלטן די איי אנטוויקלונג בעת פלאזמאדיום אינפעקציע, וואס זיכערט די געזונט פון די אינפעקטירטע נקבות. נקבות-דערייווד 20E ברענגט נישט ארויס א סעקסועלע רעאקציע. אבער ערלויבט פארמאכטע יחידים צו לייגן אייער נאכדעם וואס 20E-אינהיביטירנדע קינאזעס ווערן אינהיביטירט. די אידענטיפיקאציע פון ​​דעם זכר-ספעציפישן אינסעקט סטערויד הארמאן און זיין ראלע אין רעגולירן ווייבליכע סעקסועלע רעצעפטיוויטי, גיביקייט און אינטעראקציע מיט פלאזמאדיום סאגדזשעסטירט דעם פאטענציאל צו רעדוצירן דעם רעפראדוקטיווען ערפאלג פון מאלאריע-טראנסמיטירנדע מוסקיטעס.
מאַלאַריאַ קאַסעס און טויטפעלער זענען ווידער אויפן אויפשטייג4 צוליב ברייטער אינסעקטיציד קעגנשטעל אין אַנאָפעלעס מושקיטאָס, דער איינציקער וועקטאָר פון מענטשלעכע מאַלאַריאַ פּאַראַזיטן. די פּאָרעונג ביאָלאָגיע פון ​​די מושקיטאָס איז אַ באַזונדער אַטראַקטיוו ציל פֿאַר נייַע מאַלאַריאַ קאָנטראָל ינטערווענטשאַנז ווייַל ווייַבלעך נאָר פּאָרע זיך איין מאָל5; מאכן דעם איין פּאָרעונג געשעעניש סטעריל וואָלט האָבן גרויס פּאָטענציעל צו רעדוצירן מושקיט פּאָפּולאַציעס אין דעם פעלד.
פרויען ווערן סעקסועל אומפעאיק נאכדעם וואס זיי באקומען הויך-טיטער סטערויד הארמאנען פון מענער. שטודיעס האבן געוויזן אז דער טריגער פאר שוועריקייטן אין ווייטערדיגע פארפארונג איז 20-הידראקסיעקדיסאן (20E), א סטערויד הארמאן בעסער באקאנט אלס א רעגולאטאר פון דעם מעלטינג ציקל אין דער לאַרוואַל בינע. די מעגלעכקייט פון מענער צו סינטעזירן און טראנספערירן 20E האט זיך ספעציפיש עוואלוציאנירט אין אנאפעלעס מינים וואס זענען טייל פון דעם סובגענוס סעליאַ7, וואס איז פארשפרייט אין אפריקע און שליסט איין די מערסט געפערליכע וועקטאָרן פון מאַלאַריאַ, אריינגערעכנט אנאפעלעס גאַמביע. דאס איז ספעציעל באמערקענסווערט ווייל אין די מינים פראדוצירן די נקבות אויך 20E נאך יעדער בלוט מאלצייט, און 20E טרייבט דעם אאָגענעסיס ציקל (זעה רעף. 8). אבער, מען ווייסט ווייניג וועגן דעם וועג ווי אזוי די נקבות אינטעגרירן סיגנאלן פון צוויי פארשידענע קוועלער פון עקדיסאן (מענער טראנספער און בלוט פידינג אינדוקציע) אן קאמפראמיסירן זייער אייגענע מעגלעכקייט צו פארפּאָרן זיך. אין פאַקט, אויב די 20E וואס ווערט פראדוצירט דורך די נקבות טריגערט סעקסועלע אינטאלעראנץ, וועט דאס פירן צו נישט-פרוכטבארקייט אין יונגפרוי-פידינג מענטשן, א זייער געווענליכע אויפפירונג אין די מוסקיטאָס5.
א מעגלעכע דערקלערונג איז אז A. gambiae זכרים טראנספערירן א מאדיפיצירט זכר-ספעציפיש עקדיסאן, וואס אקטיוויזירט א סיגנאלינג קאסקאדע אין די ווייבליכע רעפראדוקטיווע טראַקט, וואס רעזולטירט אין פארפארונג אינסטאַביליטעט. אבער, כאטש ווערטעבראטן האבן קייפל סטערויד הארמאנען, ווי עסטראגען און אנדראגען (איבערגעקוקט אין רעף. 9), לויט אונזער וויסן, זענען אנדראגעניש-פאראורטיילטע סטערוידן נישט אידענטיפיצירט געווארן אין אינסעקטן.
מיר האָבן זיך גענומען באַשטימען דעם רעפּערטואַר פֿון סטערויד האָרמאָנען אין דער זכר אַקסעסאָרי דריז (MAG) פֿון סעקסואַל רייף A. gambiae אין דער זוכעניש פֿון מעגלעכע מאָדיפֿיצירנדיקע סטערוידן. ניצנדיק הויך-פּערפאָרמאַנס פֿליסיקייט כראָמאַטאָגראַפֿיע צוזאַמען מיט טאַנדעם מאַסע ספּעקטראָמעטריע (HPLC-MS/MS) אַנשטאָט דעם ווייניקער ספּעציפֿישן מעטאָד וואָס מיר האָבן פֿריִער געניצט, האָבן מיר דעטעקטירט עקדיסאָן (E) און 20E אין דעם געוועב, באַשטעטיקנדיק פֿריִערדיקן רעזולטאַט. אָבער, דער מוסטער איז געווען דאָמינירט דורך אָקסידירטע פֿאָספֿאָרילירטע סטערוידן, וואָס זענען קאָנסיסטענט מיט דער פֿאָרמולע 3-דעהידראָ-20E-22-פֿאָספֿאַט (3D20E22P)12 (פֿיגור 1). אַנדערע פֿאָרמען אַרייַננעמען 3-דעהידראָ-20E (3D20E) און 20E-22-פֿאָספֿאַט (20E22P). די HPLC-MS/MS סיגנאַל אינטענסיטעט פֿון 3D20E22P איז געווען צוויי אָרדערס פֿון מאַגניטוד העכער ווי זײַן דעפֿאָספֿאָרילירטע פֿאָרעם, 3D20E, און דריי אָרדערס פֿון מאַגניטוד העכער ווי יענע פֿון E און 20E (פֿיגור 1). כאָטש אין אַנדערע טיילן פֿון דעם גוף און דעם... נידעריגער רעפּראָדוקטיווע טראַקט (LRT; עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 1a). מיר האָבן אויך אַנאַליזירט עקדיסטערוידן אין ניי פארמאכטע (<1 טאָג אַלט) מענער און פרויען און דעטעקטירט 3D20E און 3D20E22P בלויז אין MAG; E, 20E און 20E22P זענען געווען פאָרשטעלן אין ביידע געשלעכטער (עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 1b). די דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז A. gambiae דערוואַקסענע מענער פּראָדוצירן הויך טיטערס פון מאָדיפיצירנדיק האָרמאָנעס אין זייערע MAGs וואָס ווערן נישט סינטעזירט דורך פרויען.
MAG און ווייַבלעך LRT (אַרייַנגערעכנט אַטריאַ, זוימען וועסיקלעס, און פּאַראָוואַריום) זענען דיסעקטירט געוואָרן פון 4-טאָג-אַלטע (4-טאָג-אַלטע) יונגפרוי זכרים און יונגפרוי און געפּאָרטע נקבה (0.5, 3, און 12 הפּם). עקדיסאָן אין די געוועבן איז אַנאַליזירט געוואָרן דורך HPLC-MS/MS (מיטל ± סעם; אַנפּערד ט-טעסט, צוויי-זייַטיק, פאַלש דיסקאַווערי קורס (FDR) קאָרעקטירט; NS, נישט באַטייַטיק; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 שעה קעגן 0.5 שעה, P = 0.035; 12 שעה קעגן 3 שעה, P = 0.0015; 12 שעה קעגן 0.5 שעה, P = 0.030. 3D20E22P: 3 שעה קעגן 0.5 שעה, P = 0.25; 12 שעה קעגן 3 שעה, P = 0.0032; 12 שעה קעגן 0.5 שעה, P = 0.015). די דאטן זענען פון דריי ביאלאגישע רעפליקאטן. די שפּיץ שטח פאר יעדן עקדיסאָן פון אינטערעס איז געווען קאַלקיאַלייטיד און נאָרמאַליזירט דורך די נומער פון מוסקיטאָס. עקדיסאָן איז רעפּרעזענטירט דורך קאָליר ווי גייט: E, גרין; 20E, מאַראַנץ; 20E22P, לילאַ; 3D20E, בלוי; 3D20E22P, ראָזעווע. די ינסערט פאַרגרעסערט די וואָג אויף די y-אַקס צו ווייַזן נידעריקער עקדיסאָן לעוועלס.
כדי צו אויספארשן צי 3D20E22P און 3D20E ווערן איבערגעפירט בעת פארפארונג, האבן מיר דיסעקטירט ווייבליכע LRTs אין פארשידענע צייט פונקטן נאך פארפארונג. כאטש עקדיסאן איז נישט געפונען געווארן אין יונגפרויען, האבן מיר באמערקט גרויסע סומעס פון 3D20E22P אין די LRT גלייך נאך פארפארונג (0.5 שעה נאך פארפארונג, ה/מ), פארקלענערנדיג זיך מיט דער צייט, בשעת 3D20E לעוועלס האבן זיך באדייטנד פארגרעסערט (פיגור 1). ניצנדיג כעמיש סינטעזירטן 3D20E אלס א סטאנדארט, האבן מיר באשלאסן אז די לעוועלס פון דעם סטערויד הארמאן אין פארפארונג LRTs זענען געווען לפחות 100 מאל העכער ווי 20E (פארברייטערטע דאטן טאבעלע 1). אזוי, 3D20E22P איז דער הויפט זכר עקדיסאן וואס ווערט איבערגעפירט צום ווייבליכע LRT בעת פארפארונג, און זיין דעפאספארילירטע פארעם, 3D20E, ווערט זייער פארשפרייט באלד נאך פארפארונג. דאס ווייזט אויף א וויכטיגע ראלע פאר די לעצטע עקדיסאן אין ווייבליכע נאך-פארפארונג ביאלאגיע.
נאכדעם וואס מיר האבן גענערירט א נייע RNA סיקווענסינג (RNA-seq) דאטאסעט (פיגור 2a), ניצנדיג א ספעציעל-געבויטע ביאאינפארמאטיקס פייפליין, האבן מיר געזוכט פאר עקדיסאן קינאזע (EcK), עקדיסאן אקסידאז (EO), און עקדיסאן וואס קאדירן דעם 20E-מאדיפיצירטן פאספאטאז גען. EPP) ווערט אויסגעדריקט אין רעפראדוקטיווע געוועבן. מיר האבן אידענטיפיצירט איין קאנדידאט EPP גען און צוויי מעגליכע EcK גענען (EcK1 און EcK2), אבער מיר האבן נישט געקענט געפינען א גוטן קאנדידאט EO גען. באמערקענסווערט, זענען יחידישע EPP גענען אויסגעדריקט געווארן אויף הויכע לעוועלס (98.9טע פראצענטיל) אין גאמביאנישע MAGs אבער נישט אין ווייבליכע LRTs (פיגור 2b), פארקערט צו אונזערע ערווארטונגען ווייל דעפאספארילאציע פון ​​3D20E22P איז פארגעקומען אין דעם ווייבליכן געוועב. דעריבער, גלייבן מיר אז זכר EPP קען ווערן טראנספערירט בעת פארפארונג. טאקע, מיר האבן גענוצט אין וויווא סטאבילן איזאטאפ לייבלינג צו באהאלטן דעם ווייבליכן פראטעין נאך פארפארונג, אן ענזיים אידענטיפיצירט דורך MS אין דעם ווייבליכן אטריום (פיגור 2c און סופּלעמענטארע טאבעלע 1). די אנוועזנהייט פון EPP אין MAG און געפּאָרטע (אָבער נישט יונגפרוי) ווייַבלעך LRT איז אויך באַשטעטיקט געוואָרן מיט ספּעציפֿישע אַנטיקערפּערס (פיגור 2ד).
א, א ספעציעל-געבויטע ביאאינפארמאטיק רערנ-ליניע צו זוכן די רעפּראָדוקטיווע געוועבן פון יעדן געשלעכט פֿאַר גענעס וואָס קאָדירן EcKs, EOs, און EPPs. די נומערן לעבן די פײַלן ווײַזן די צאָל פון זכר און נקבה קאַנדידאַטן אין יעדן שריט. די אַנאַליז האט אידענטיפיצירט איין EPP גען (EPP) און איין EcK גען (EcK1) וואָס ווערן אויסגעדריקט אין זכר, און איין EcK גען (EcK2) וואָס ווערט אויסגעדריקט אין ביידע געשלעכטער אָבער גיט נישט קיין קאַנדידאַט EO גען. ב, היץ מאַפּע וואָס פאַרגלײַכט קאַנדידאַט גען אויסדרוק אין יונגפֿרױ (V) און פּאָרעונג (M) אַנאָפֿעלעס גאַמביע און אַנאָפֿעלעס אַלביקאַנס געוועבן. Spca, פערטיליזאַציע; MAGs, אַקסעסאָרי דריזן אין זכר; אנדערע טיילן פון דעם קערפער, אריינגערעכנט ברוסטן, פליגלען, פיס, פעטע קערפערס, און אינערליכע ארגאנען אין ביידע געשלעכטער, און אוואריעס אין פרויען. EcK2 איז שטארק אויסגעדריקט אין ביידע MAG און אטריא פון גאמביע, משא"כ EPP איז געפונען נאר אין MAG.c, פראטעאמישע אנאליז פון זכר עיאקולאט גרופע טראנסלאקאציע אין נקבה אטריא ביי 3, 12 און 24 ה/מ, ווייזנדיג די 67 מערסטע פארשפרייטע פראטעאינען. פרויען זענען אויפגעצויגן געווארן אויף א דיעטע מיט 15N צו לייבלען (און באהאלטן) אלע פראטעאינען. נישט-געטעגטע זכרים זענען געפארט מיט געטעגטע נקבה, און נקבה LRTs זענען דיסעקטירט געווארן ביי 3, 12 און 24 ה/מ פאר פראטעאמישע אנאליז (זעה סופּלעמענטארע טאבעלע 1 פאר א פולשטענדיגע ליסטע פון ​​עיאקולאטארישע פראטעאינען).אינסעט, EPP, Eck1 און EcK2 זענען דעטעקטירט געווארן אין די MAG פון יונגפרוי זכרים דורך פראטעאמישע אנאליז פון די געוועבן.d, EPP איז דעטעקטירט געווארן דורך וועסטערן בלאט אין MAG און LRT פון געפארטע נקבה, אבער נישט אין יונגפרוי נקבה אדער זכרים אדער די רעשט פון די נקבה קערפער.מעמבראנען זענען סיימאַלטייניש... געפּרובירט מיט אַנטי-אַקטין (לאָודינג קאָנטראָל) און אַנטי-EPP אַנטיקערפּערס. אַלע מענער זענען יונגפרויען. זעט סאַפּלעמענטאַרי פיגור 1 פֿאַר געל מקור דאַטן. וועסטערן בלאָטס זענען דורכגעפירט געוואָרן צוויי מאָל מיט ענלעכע רעזולטאַטן.
די עקדיסטערויד פאספאפאטאז אקטיוויטעט פון EPP איז וועריפיצירט געווארן נאך אינקובאציע דורך HPLC-MS/MS מיט 3D20E22P אפגעזונדערט פון MAG (עקסטענדעד דאטן פיג. 2a). ווייטער, ווען מיר האבן שטיל געמאכט EPP דורך RNA-מעדיאַטעד אינטערפערענס (RNAi), האבן מיר דעטעקטירט א שטארקע רעדוקציע אין פאספאטאז אקטיוויטעט אין די רעפּראָדוקטיווע געוועבן פון די זכרים (פיג. 3a), און נקבות געפּאָרט מיט EPP-שטיל געמאכטע זכרים האבן געוויזן באַדייטנדיק א נידעריקער פּראָפּאָרציע פון ​​דעפאספארילירט 3D20E (פיג. 3b) טראָץ טיילווייזע גען שטיל מאכן (עקסטענדעד דאטן פיג. 2b,c). אין קאַנטראַסט, האבן מיר נישט דעטעקטירט באַדייטנדיקע ענדערונגען אין די 20E22P/20E פאַרהעלטעניש אין די זעלבע מאַסקיטאָס, וואָס קען פֿאָרשלאָגן אַז דער ענזיים איז ספּעציפֿיש פֿאַר 3D20E22P (פיג. 3b).
א, פארקלענערטע פאספאטאזע אקטיוויטעט אין MAG געפֿארזאַכט דורך EPP שטילשטעלנדיק ניצנדיק טאָפּל-שטראַנדיק EPP RNA (dsEPP) אדער טאָפּל-שטראַנדיק GFP RNA (dsGFP) קאָנטראָלן. צוואַנציק MAG פּולן זענען גענוצט געוואָרן אין יעדן רעפּליקאַט (P = 0.0046, געפּאָרט ט-טעסט, צוויי-זייַטיק), רעפּרעזענטירט דורך באַזונדערע פּונקטן. ב, ווייַבלעך געפּאָרט מיט EPP-שטילשטעלטע זכרים האָבן געהאַט אַ באַדייטנד נידעריקער פּראָפּאָרציע פון ​​דעפאָספאָרילירט 3D20E ביי 3 הפּם (P = 0.0043, אַנפּערד ט-טעסט, צוויי-זייַטיק), כוועראַז 20E לעוועלס זענען געווען נישט אַפעקטאַד (P = 0.063, אַנפּערד). ט-טעסט, צוויי-זייטיג).דאטן ווערן פרעזענטירט אלס דורכשניט ± סעם פון דריי פּולס פון 13, 16 און 19 נקבות יעדע.c, נקבות וואָס זענען געפּאָרט געוואָרן מיט EPP-שטילגעמאַכטע זכרים האָבן געהאַט באַדייטנד העכערע ראַטעס פון ווידער-פּאָרונג (P = 0.0002, פישער'ס עקזאַקטער טעסט, צוויי-זייטיג).נקבות זענען ערשט געצוואונגען געוואָרן צו פּאָרן זיך צו זיכער מאַכן זייער פּאָרונג סטאַטוס; 2 טעג שפּעטער, זענען זיי קאָנטאַקטירט געוואָרן מיט אַנדערע מענער וואָס האָבן געטראָגן טראַנסגענישע זיירע צו אָפּשאַצן די ווידער-פּאָרונג ראַטעס דורך קוואַנטיטאַטיווע PCR דעטעקציע פון ​​דעם טראַנסגענע.d, בלוט-געפיטערטע ווייַבלעך וואָס זענען געפּאָרט געוואָרן מיט EPP-שטילגעשטעלטע מענער האָבן געהאַט באַדייטנד פאַרקלענערטע פרוכטבאַרקייט (P < 0.0001; מאַנן-וויטני טעסט, צוויי-זייטיג) און אַ ביסל פאַרקלענערטע אייער נומער (P = 0.088, מאַנן-וויטני טעסט, צוויי-זייטיג), בשעת די ספּאָנינג קורס איז נישט געווען אַפעקטירט (P = 0.94, פישער'ס עקזאַקטער טעסט, צוויי-זייטיג).אין אַלע פּאַנאַלז, n רעפּרעזענטירט די נומער פון ביאָלאָגיש אומאָפּהענגיקע מוסקיטאָ מוסטערן.NS, נישט באַדייטנד.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
ווייטער, האבן מיר אפגעשאצט צי עקדיסאן דעפאספארילאציע איז וויכטיג פארן אינדוצירן פארפארונג קעגנשטאנד אין נקבות. באמערקענסווערט, נקבות וואס זענען געפארעט געווארן מיט EPP-אויסגעשעפטע זכרים האבן זיך ווידער געפארעט מיט א פיל העכערער פרעקווענץ (44.9%) ווי קאנטראל נקבות (10.4%) ווען זיי זענען אויסגעשטעלט געווארן צו נאָך (טראַנסגעניק) זכרים (פיגור 3c). מיר האבן אויך באמערקט א באדייטנדיקע פארקלענערונג אין פרוכטבארקייט (פיגור 3d, לינקס) און א קליינע פארקלענערונג אין דער צאל אייער געלעגט דורך די נקבות (פיגור 3d, מיטן), בשעת דער פראצענט אייער געלעגט דורך נקבות (נאך א רעאקציע ארויסגערופן אין נקבות דורך פארפארונג)) זענען נישט געווען באאיינפלוסט (פיגור 3d, רעכטס). געגעבן די באאבאכטעטע ספעציפישעקייט פון EPP פאר 3D20E22P, ווייזן די רעזולטאטן אז די אקטיוואציע פון ​​3D20E דורך EPP טראנספערירט בעת פארפארונג קען האבן א וויכטיגע ראלע אין אויסלעשן נקבות'ס רעצעפטיוויטעט צו ווייטערדיקע פארפארונג, א אויפפירונג וואס מען האט פריער צוגעשריבן צו דער סעקסואַלער איבערפיר פון 20E. דעריבער, באאיינפלוסט דאס זכר-ספעציפישע הארמאן אויך שטארק נקבות'ס פרוכטבארקייט.
ווייטער, האבן מיר פארגליכן די אקטיוויטעטן פון 20E און 3D20E אין אינדזשעקציע עקספערימענטן אין סעקסועל-רייף יונגפרויען ניצנדיג כעמיש סינטעזירטן 3D20E (פיגור 4a-c) און קאמערציעל בנימצא 20E. מיר האבן באמערקט אז 3D20E איז געווען באדייטנד מער עפעקטיוו ווי 20E אין אפשטעלן ווייַבלעך סענסיטיוויטי צו פּאָרעווען ביי ביידע קאַנסאַנטריישאַנז (פיגור 4d). באַמערקענסווערט, העלפט פון די פיזיאַלאַדזשיקאַל מדרגה פון 3D20E אין די LRT (1,066 פּג נאָך-אינדזשעקציע קעגן 2,022 פּג נאָך פּאָרעווען) האט ינדוסט אַ פּראָפּאָרציע פון ​​​​רעפראַקטאָרי ווייַבלעך וואָס איז געווען 20-פאַך העכער ווי די פיזיאַלאַדזשיקאַל מדרגה פון 20E (361 פּג נאָך-אינדזשעקציע) 24 שעה נאָך אינדזשעקציע ביי דער העכסטער קאַנסאַנטריישאַן 18 פּג נאָך פּאָרעווען; פארברייטערטע דאטן טאבעלע 1). דאס רעזולטאט איז קאנסיסטענט מיט דער השערה אז סעקסועלע טראנספער פון 20E פאראורזאכט נישט קיין פארפארונגס-רעפראקטארישע פעריאדן, און ווייזט ווייטער אויף 3D20E אלס א הויפט פאקטאר אין זיכער מאכן עלטערן-קינד באציאונג. 3D20E איז אויך געווען באדייטנד מער אקטיוו ווי 20E אין איי-לייגן פראבעס אין יונגפרוי נקבות (פיגור 4e), וואס סאגדזשעסט אז די נארמאלע איי-לייגן ראטע וואס מיר האבן באמערקט נאך טיילווייזע EPP שטילמאכן איז געווען צוליב דעם אנוועזנהייט פון רעזידועל 3D20E אקטיוויטעט נאך אלץ פראדוצירט דורך פארפארונגס-אינדוצירטע נקבות פאקטארן.
(א,ב) 3D20E כעמיש סינטעזירט פון 20E (א) מיט זייער הויכער קאנווערזיע/עפעקטיווקייט (דאטן פרעזענטירט אלס דורכשניט ± סעם פון דריי אומאפהענגיקע סינטעז רעאקציעס) (ב).ג, מאסע ספעקטרום (אונטערשטע העלפט) שטימט פונקטליך מיט עקדיסאן געפונען אין געפארטע ווייבליכע LRT (אויבערשטע העלפט).ד, פארגליכן מיט 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; פישער'ס עקזאקטער טעסט, צוויי-זייטיק) און 10% עטאנאל (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; פישער'ס עקזאקטער טעסט, צוויי-זייטיק), בשעת 20E איז געווען באדייטנד העכער ווי קאנטראל נאר ביי העכערע דאזעס (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; פישער'ס עקזאקטער טעסט, צוויי-זייטיק).ה, 3D20E אינדזשעקציע האט אינדוצירט באדייטנד העכערע לאגער-ראטעס אין יונגפרויען ווי 10% עטאנאל קאנטראלן (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; פישער'ס עקזאקטער טעסט, צוויי-זייטיק), בשעת 20E האט פארגליכן מיט קאנטראלן נאר ביי העכערע דאזעס (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; פישער'ס עקזאקטער טעסט, צוויי-זייטיק).3D20E האט אינדוצירט באדייטנד העכערע לאגער-ראטעס ווי 20E ביי העכערע דאזעס (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; פישער'ס עקזאקטער טעסט, צוויי-זייטיק).אין אלע פאנעלן, n רעפרעזענטירט די צאל פון ביאלאגיש אומאפהענגיקע מוסקיטא מוסטערן.NS, נישט באדייטנד.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.דאטן זענען פון דריי רעפּליקאַציעס.
אין פריערדיקע שטודיעס, האבן מיר באשטימט אז סעקסועלע טראנספער פון סטערויד הארמאנען אינדוצירט די אויסדרוק פון MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), א ווייבליכע רעפראדוקטיווע גען וואס באשיצט A. gambiae ווייבער פון P. falciparum אינפעקציע. געזונט קאסטן געפארשאפט דורך 13, די טויטליכסטע מענטשליכע מאלאריע פאראזיט. געגעבן די וויכטיקייט פון MISO צו די רעפראדוקטיווע געזונטהייט פון אנאפעלעס אין מאלאריע-ענדעמישע געביטן, האבן מיר באשלאסן צו באשטימען וועלכע הארמאן 3D20E אדער 20E טריגערט די אויסדרוק פון דעם גען. מיר האבן געפונען אז כאטש 20E אינדזשעקציע ספעציפיש אדער מער שטארק אינדוצירט געוויסע נוקלעארע הארמאן רעצעפטארן (HR), ווי HR3 און HR4, און טיפישע דאון-סטרים סטערויד צילן, ווי די יאלקאגענישע גענעס Vg14, 15, 16, איז MISO שטארקער אינדוצירט געווארן דורך 3D20E (Extended Data Fig. 3). אזוי, די סעקסועלע טראנספער פון דעם אנדראגענישן סטערויד הארמאן שיינט צו אינדוצירן מעכאניזמען וואס באשיצן ווייבער פון די קאסטן וואס ווערן געשטעלט דורך פאראזיטיש אינפעקציע. ווייטער, 3D20E באאיינפלוסט דיפערענציעל ביידע איזאפארמען פון די... E רעצעפּטאָר EcR, וואָס אינדוצירט EcR-A און אונטערדריקט EcR-B, און שטאַרקער טריגערט אַנדערע פּאָרעונג-אינדוצירנדיקע גענעס, אַרייַנגערעכנט HPX15, וואָס אַפעקטירט ווייַבלעך גיביקייַט. דאָס קען דערקלערן די באַטייטיק ינפערטיליטי באמערקט אין ווייַבלעך וואָס זענען געפּאָרט מיט EPP-סיילאַנסט זכר (עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 3). די דאַטן פֿאָרשלאָגן די עקזיסטענץ פון דאַונסטרים פּאַטווייז פּרעפערענטשאַלי אַקטיווייטיד דורך צוויי עקדיסאָן האָרמאָנעס וואָס קען ליגן אונטער געשלעכט-ספּעציפֿיש פונקציע.
ווייטער, האבן מיר געטעסט די פונקציע פון ​​די צוויי EcK גענעס וואס זענען אידענטיפיצירט געווארן אין אונזער ביאאינפארמאטיקס רערנליניע. שטיל מאכן EcK1 אדער EcK2 האט רעזולטירט אין באדייטנדיקע שטערבליכקייט ביי מענער (פארברייטערטע דאטן פיג. 4א), וואס ווייזט אז עקדיסאן פאספארילאציע, און אזוי אינאקטיוויזאציע, איז וויכטיג פאר איבערלעבן. ווייל EcK2 איז אויסגעדריקט געווארן אויף העכערע לעוועלס ווי EcK1 און איז דעטעקטירט געווארן אין MAGs דורך פראטעאמיקס (פיג. 2ב,ג און צוגאב טאבעלע 2), האבן מיר וואַלידירט זיין עקדיסטערויד קינאזע אקטיוויטעט דורך אינקובירן עס מיט 20E, וואס האט רעזולטירט אין פאספארילאציע 20E22P (פארברייטערטע דאטן פיג. 2).4ב). ווען מיר האבן גענוצט 3D20E אלס א סובסטראט, האבן מיר נישט געקענט דעטעקטירן דעם פאספארילירטן פראדוקט 3D20E22P (פארברייטערטע דאטן פיג. 4ג), וואס ווייזט אז 20E אנשטאט 3D20E קען זיין די בילכער ציל פון EcK2.
לויט אונדזער RNA-seq אנאליז, איז EcK2 אויך שטארק אויסגעדריקט געווארן אין די LRT פון יונגפרויען, וואו עס איז אויסגעלאשן געווארן נאך פארפארונג (פיגור 2ב). מיר האבן באשטעטיקט די דאטן און באשלאסן אז EcK2 אויסדרוק איז נישט געווען באאיינפלוסט דורך בלוט עסן (פארברייטערטע דאטן פיגור 5א). פארברייטערנדיג אונדזערע ערשטע MS עקספערימענטן, האבן מיר באשלאסן אז דער שפיץ פון 20E22P איז געווען ענג פארבונדן מיטן שפיץ פון 20E (22-26 שעה נאך בלוט מאלצייט; פארברייטערטע דאטן פיגור 5ב). שטילמאכן EcK2 אין יונגפרויען האט רעזולטירט אין א 3-פאכיגע פארגרעסערונג אין די רעלאטיווע פראפארציע פון ​​20E צו 20E22P ביי 26 שעה נאך בלוט מאלצייט (פארברייטערטע דאטן פיגורן 2ק און 5ק), באשטעטיגנדיג אז EcK2 פאספארילירט אויך 20E אין פרויען. באמערקענסווערט, EcK2-אויסגעשעפטע יונגפרויען האבן געהאלטן פולע סעקסועלע רעצעפטיוויטי (פארברייטערטע דאטן פיגור 5ד,ע), ווייטער סאגדזשעסטיד אז פרויען פראדוקציע פון ​​20E אינדוצירט נישט פארפארונג רעפראקטארישע פעריאדן. אבער, די פרויען האבן געהאט באדייטנד... פארגרעסערטע אייער-לייגן ראטעס קאמפערד צו קאנטראל, מיט מער ווי 30% פון יונגפרויען לייגן אייער (עקסטענדעד דאטן פיג. 5f). אויב טאָפּל-שטראַנדעד Eck2 RNA (dsEcK2) ינדזשעקשאַנז זענען דורכגעפירט געוואָרן נאָך בלוט פידינג, ספּאָנינג איז נישט פארגעקומען, אין וועלכן פונקט די 20E שפּיץ רעכט צו בלוט אייננעמען איז געפאלן. אין אַלגעמיין, די רעזולטאַטן שטיצן אַ מאָדעל אַז 20E פּראָדוצירט נאָך בלוט זויגן קען פאַראורזאַכן ספּאָנינג, אָבער בלויז ווען די ספּאָנינג בלאָק (EcK2 און מעגלעך אנדערע סיבות) איז אויסגעלאָשן דורך פּאָרעונג. ניט 20E און ניט 3D20E ינדזשעקשאַנז האָבן ינכיבאַטיד EcK2 אויסדרוק אין יונגפרויען (עקסטענדעד דאטן פיג. 5g), וואָס סאַגדזשעסטיד אַז אנדערע סיבות מעדיאַטירן די ינכיבישאַן פון דעם קינאַזע. אָבער, 20E לעוועלס נאָך בלוט פידינג זענען נישט גענוג צו פאַראורזאַכן פּאָרעונג ומבאַקוועמקייַט, אָבער זענען עפעקטיוולי טריגערד דורך הויך טיטערס פון סעקסואַלי טראַנספערד 3D20E.
אונדזערע רעזולטאַטן געבן וויכטיקע איינבליקן אין די מעכאניזמען וואָס רעגולירן דעם רעפּראָדוקטיווען הצלחה פון A. gambiae. א מאָדעל איז ארויסגעקומען וואו מענער האָבן זיך אַנטוויקלט צו סינטעזירן הויכע טיטערס פון 3D20E, אַ זכר-ספּעציפֿיש מאָדיפֿיצירטער עקדיסאָן וואָס גאַראַנטירט אָפּשטאַמונג דורך דעסענסיטיזירן ווייַבלעך צו ווייטערדיקע פּאָרעונג. אין דער זעלבער צייט, די מאַלאַריאַ וועקטאָרן האָבן אויך אַנטוויקלט אַן עפֿעקטיוו סיסטעם צו אַקטיווירן 3D20E אין ווייַבלעך אין ענטפער צו די סעקסואַל טראַנספֿער פון זכר-ספּעציפֿיש EPP. לויט אונדזער וויסן, דאָס איז דער ערשטער בייַשפּיל פון אַ זכר- און ווייַבלעך-דאָמינירט סטערויד האָרמאָן סיסטעם וואָס פּערפאָרמז אַ יינציק און קריטיש פונקציע אין ינסעקטן. זכר-ספּעציפֿיש עקדיסאָן פונקציע איז געווען פּאָסטולירט אָבער נישט דעפֿיניטיוו דעמאַנסטרירט. למשל, אַ לאַרגעלי אָפּגעוואָרפן היפּאָטעזע 18 איז אַז די פונקציעס קען זיין דורכגעפֿירט דורך די 20E פּרעקורסאָר E1. עס איז באַוווסט אַז אין דראָסאָפילאַ, מאָנאַנדרי איז טריגערד דורך די סעקסואַל טראַנספֿער פון קליינע סעקס פּעפּטיידז 19,20 וואָס ינטעראַקט מיט נעוראָנס יננערווייטינג די ווייַבלעך רעפּראָדוקטיווע טראַקט דורך ספּעציפֿיש סעקס פּעפּטייד רעסעפּטאָרס 21,22. ווייטערדיקע אַרבעט איז פארלאנגט צו באַשטימען די דאַונסטרים סיגנאַלינג. קאַסקאַדעס קאָנטראָלירט דורך 3D20E אין A. gambiae ווייַבלעך און צו באַשטימען צי די קאַסקאַדעס קענען זיין קאָנסערווירט צווישן מאַסקיטאָס און דראָסאָפילאַ.
געגעבן די וויכטיגע ראלע פון ​​3D20E אויף ווייַבלעך גיביקייַט און נאַטור וואָס איז געווען אידענטיפיצירט אין אונדזער שטודיע, די פּאַטווייז וואָס פירן צו 3D20E סינטעז און אַקטיווירונג פאָרשלאָגן נייַע אַפּערטונאַטיז פֿאַר צוקונפֿט מאַסקיטאָ קאָנטראָל סטראַטעגיעס, אַזאַ ווי די דזשענעריישאַן פון קאַמפּעטיטיוו סטערילע זכר אין סטערילע ינסעקט טעכנאָלאָגיע סטראַטעגיעס ניצן פֿאַר ווילד מעלדונג אָדער צו נאָכמאַכן די 3D20E אין יונגפרוי שפּיל. די זכר-ספּעציפיש פונקציע פון ​​3D20E קען האָבן יוואַלווד ווען A. gambiae און אנדערע סעליאַ מינים קונה די פיייקייט צו קאָואַגיאַלייט זייער זיירע אין פּאָרינג פּלאַגז, ווייַל דאָס אַלאַוז פֿאַר די עפעקטיוו אַריבערפירן פון גרויס נומערן פון כאָרמאָונז און האָרמאָנע-אַקטיווייטינג ענזימעס. אין קער, 3D20E עוואָלוציע ימפּלאַמענטינג מאָנאַנדרי גיט אַ מעקאַניזאַם פֿאַר ווייַבלעך (דורך הויך אויסדרוק פון MISO) צו באַגינציקן זייער רעפּראָדוקטיווע טויגיקייט אין געביטן פון הויך מאַלאַריאַ פּרעוואַלאַנס, וואָס מינאַצאַד קאַנטריביוץ צו פּלאַזמאָדיום טראַנסמיסיע. געגעבן אַז ווייַבלעך 20E איז געוויזן צו האָבן טיף יפעקס אויף די ניצל און וווּקס פון P. falciparum אין ווייַבלעך אַנאָפעלעס מאַסקיטאָוז,24 ביידע זכר און ווייַבלעך סטערויד האָרמאָנע פּאַטווייז זענען איצט שליסל אַספּעקטן פון מאַסקיטאָ-פּאַראַסיט ינטעראַקשאַנז.
A. gambiae G3 שטאַמען זענען אויפגעצויגן געוואָרן אונטער נאָרמאַלע אינסעקטן באַדינגונגען (26-28 °C, 65-80% רעלאַטיווע הומידיטי, 12:12 שעה ליכט/פינצטער פאָטאָפּעריאָד). לאַרווע זענען געפיטערט געוואָרן מיט פּודערדיקער פיש עסן (טעטראַמין טראָפּיקאַל פלאַקעס, קאָי פּעלאַץ און טעטראַ פּאָנד סטיקס אין אַ פּראָפּאָרציע פון ​​7:7:2). דערוואַקסענע מושקיטאָס זענען געפיטערט געוואָרן אַד ליביטום 10% דעקסטראָז לייזונג און וועכנטלעך מענטשלעך בלוט (שטודיע בלוט קאָמפּאָנענטן). יונגפרוי מושקיטאָס זענען באַקומען געוואָרן דורך סעגרעגירן די געשלעכטער אין דער פּופּאַל בינע נאָך דורכקוקן די ענדס דורך מיקראָסקאָפּיע. זכרים וואָס טראָגן דעם DsRed טראַנסגענע זענען פריער באַשריבן געוואָרן.
געצוואונגענע פארפארונג עקספערימענטן זענען דורכגעפירט געווארן לויט פריער באשריבענע פראטאקאלן. פאר נאטירלעכע פארפארונג, זענען 4-טאג-אלטע יונגפרוי נקבות געהאלטן געווארן אין א 1:3 פראפארציע מיט סעקסועל-רייפ יונגפרוי זכרים פאר צוויי נעכט. פאר עקספערימענטן אין וועלכע זכרים זענען אינדזשעקטירט געווארן מיט dsEPP, איז קא-קעידזשינג צוזאמענגעפאלן מיט טעג 3-4 נאך דער אינדזשעקציע, ווען פאספאטאזע אקטיוויטעט איז געווען מאקסימאל שטיל געמאכט (פארברייטערטע דאטן פיג. 2ב).
מאַסקיטאָ געוועבן, פארבליבענע קאַדאַווערס (רעשט פון דעם גוף), אָדער דער גאַנצער גוף זענען דיסעקטירט געוואָרן אין 100% מעטאַנאָל און כאָומאַדזשענייזד מיט אַ בעאַדער (2 מם גלאז קרעלן, 2,400 רפּם, 90 סעקונדעס). געוועב סומעס און מעטאַנאָל וואַליומז זענען געווען ווי פאלגט: רעשט פון גוף, 50 אין 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; ווייַבלעך LRT, 25–50 80 µl. דער אָפּזאַץ איז געווען אונטערטעניק צו אַ צווייטע מעטאַנאָל עקסטראַקציע מיט דעם זעלבן באַנד פון מעטאַנאָל. צעל דעבריס איז אַוועקגענומען דורך צענטריפוגאַציע. דער מעטאַנאָל פון ביידע עקסטראַקציעס איז געווען קאַמביינד און געטריקנט אונטער אַ שטיקשטאָף שטראָם, און דערנאָך ווידער סוספּענדירט אין די פאלגענדע וואַליומז פון 80% מעטאַנאָל אין וואַסער: רעשט פון דעם גוף, 50 µl; MAGs און ווייַבלעך LRT, 30 µl.
די מוסטערן זענען אנאליזירט געווארן אויף א מאסע ספעקטראמעטער (ID-X, טערמא פישער) פארבונדן מיט אן LC אינסטרומענט (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl פון דער מוסטער איז אינדזשעקטירט געווארן אויף א 3 µm, 100 × 4.6 מ״מ זייל (Inspire C8, Dikma) געהאלטן ביי 25 °C. די מאבילע פאזעס פארן LC זענען געווען A (וואסער, 0.1% פארמיק זויער) און B (אצעטאניטריל, 0.1% פארמיק זויער). דער LC גראדיענט איז געווען ווי פאלגט: 5% B פאר 1 מינוט, דערנאך פארגרעסערט צו 100% B איבער 11 מינוט. נאך 8 מינוט ביי 100%, ווערט די זייל ווידער אויסגעגליכן ביי 5% B פאר 4 מינוט. די שטראם ראטע איז געווען 0.3 מל מינוט-1. יאניזאציע אין דער MS מקור ווערט אויסגעפירט דורך געהייצעטע עלעקטראשפריי יאניזאציע אין פאזיטיווע און נעגאטיווע מאָדעס.
דער מאַסע ספּעקטראָמעטער מעסט דאַטן אין די m/z קייט פון 350 ביז 680 ביי 60,000 רעזאָלוציע אין פול MS מאָדע. MS/MS דאַטן זענען באַקומען אויף [M + H]+ (אַלע צילן), [M - H2O + H]+ (אַלע צילן), און [M - H]- (פאָספאָרילירטע צילן). MS/MS דאַטן זענען געניצט צו באַשטעטיקן די עקדיסאָן אייגנשאַפטן פון צילן פֿאַר וועלכע קיין סטאַנדאַרט איז נישט געווען בנימצא. צו ידענטיפיצירן נישט-געצילטע עקדיסטערוידן, MS/MS דאַטן פֿאַר אַלע HPLC פּיקס מיט >15% רעלאַטיוו שעפע זענען אַנאַליזירט. קוואַנטיפיצירן ניצן סטאַנדאַרט קורוועס באשאפן פון ריין סטאַנדאַרדס (20E, 3D20E) צו רעכענען אַבסאָלוטע אַמאַונץ אָדער דיילושאַנז פון איין ספּעציפיש מוסטער (אַלע אנדערע צילן) צו רעכענען זייער עקוויוואַלענץ צו די אַמאַונץ געפֿונען אין איין זכר. פֿאַר 3D20E, קוואַנטיפיקאַציע איז דורכגעפירט ניצן די סומע פון ​​די פאלגענדע אַדאַקטן: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.דאטן זענען עקסטראַקטירט און קוואַנטיפיצירט מיט Tracefinder (ווערסיע 4.1).MS/MS דאטן זענען אַנאַליזירט מיט Xcalibur (ווערסיע 4.4).די MS ספּעקטראַ פון E, 20E און 3D20E זענען קאַמפּערד צו די ריספּעקטיוו סטאַנדאַרדס.3D20E22P איז אַנאַליזירט דורך דעריוואַטיזאַציע מיט Girard's רעאַגענט.20E22P איז אַנאַליזירט דורך m/z פאַרהעלטעניש.
3D20E22P איז גערייניקט געוואָרן פֿון MAG. רייניקונג איז דורכגעפֿירט געוואָרן אויף אַן אַנאַליטישער סקאַלע מיט אַן אולטראַ-פּערפאָרמאַנס ליקוויד כראָמאַטאָגראַף (Acquity, Waters) מיט אַ קוואַדרופּאָל מאַסע-באַזירטן דעטעקטאָר (QDa, Acquity, Waters) אונטער די זעלבע LC באַדינגונגען ווי די HPLC-MS/MS אַנאַליז. פֿראַקציע זאַמלונג איז טריגערד געוואָרן ווען די m/z קאָרעספּאָנדירנדיק צו 3D20E22P איז דעטעקטירט געוואָרן אין דער זעלבער ריטענשאַן צייט ווי פריער באַשטימט. די ריינקייט פֿון די עקסטראַקטירטע קאַמפּאַונדז איז דעמאָלט געקאָנטראָלירט געוואָרן דורך HPLC-MS/MS ווי באַשריבן אויבן.
גאַנץ RNA איז עקסטראַקטירט געוואָרן פֿון 10-12 רעפּראָדוקטיווע געוועבן אָדער אַנדערע טיילן פֿונעם קערפּער (אָן קאָפּ) ניצנדיק TRI רעאַגענט (טהערמאָ פֿישער) נאָכפֿאָלגנדיק די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט. RNA איז באַהאַנדלט געוואָרן מיט TURBO DNase (טהערמאָ פֿישער). cDNA איז סינטעזירט געוואָרן ניצנדיק מאָלאָני מורינע לוקימיאַ ווירוס ריווערס טראַנסקריפּטאַסע (M-MLV RT; טערמאָ פֿישער) נאָכפֿאָלגנדיק די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט. פּריימערס פֿאַר ריווערס טראַנסקריפּציע קוואַנטיטאַטיווע PCR (RT-qPCR; עקסטענדעד דאַטאַ טאַבעלע 2) זענען פֿריִער פֿאַרעפֿנטלעכט געוואָרן24 אָדער דיזיינד ניצנדיק Primer-BLAST26, מיט אַ פּרעפֿערענץ געגעבן צו פּראָדוקטן פֿון 70-150 bp אין גרייס און וואָס שפּאַנען עקסאָן-עקסאָן דזשאַנקשאַנז אָדער פּריימער פּאָר פּריימערס באַזונדערע עקסאָנס. cDNA סאַמפּאַלז פֿון דריי ביז פֿיר ביאָלאָגישע רעפּליקאַטעס זענען דיילוטאַד פֿיר-פֿאַך אין וואַסער פֿאַר RT-qPCR. קוואַנטיפֿיקאַציע איז דורכגעפֿירט געוואָרן אין 15 µl רעפּליקאַט רעאַקציעס מיט 1× PowerUp SYBR גרין מאַסטער מיקס (טהערמאָ פֿישער), פּריימערס, און 5 µl פֿון דיילוטאַד cDNA. רעאַקציעס זענען געלאָפֿן אויף אַ QuantStudio 6 Pro רעאַל-טיים. די PCR סיסטעם (טהערמאָ פישער) און דאַטן זענען געזאַמלט און אַנאַליזירט געוואָרן ניצנדיק דיזיין און אַנאַליז (ווערסיע 2.4.3). ווי דעמאָנסטרירט אין דעם לערנען, זענען די רעלאַטיווע סומעס נאָרמאַליזירט געוואָרן צום ריבאָסאָמאַל גען RpL19 (AGAP004422), וועמענס אויסדרוק האט זיך נישט באַדייטנד געביטן מיט בלוט-פיטערונג 27 אדער פּאָרונג 3 .
RNA קוואַליטעט איז געווען געטשעקט מיט אַן Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina פּערד-ענד לייברעריז זענען צוגעגרייט און געלאָפן ביים Broad Institute of MIT און Harvard. סיקווענסינג רידס זענען אַליינד צו די A. gambiae גענאָם (PEST שטאַם, ווערסיע 4.12) מיט HISAT2 (ווערסיע 2.0.5) מיט פעליקייַט פּאַראַמעטערס. רידס מיט מאַפּינג קוואַליטעט (MAPQ) סקאָרז <30 זענען אַוועקגענומען מיט Samtools (ווערסיע 1.3.1). די נומער פון רידס מאַפּט צו גענעס איז געווען געציילט מיט htseq-count (ווערסיע 0.9.1) מיט פעליקייַט פּאַראַמעטערס. נאָרמאַליזעד ריד קאַונץ זענען קאַלקיאַלייטיד און דיפערענטשאַל דזשין עקספּרעסיע אַנאַלייזד מיט די DESeq2 פּעקל (ווערסיע 1.28.1) אין R (ווערסיע 4.0.3).
עקדיסאָן-מאָדיפיצירנדיקע גען קאַנדידאַטן זענען אידענטיפיצירט געוואָרן דורך ערשט זוכן דעם A. gambiae גענאָם ניצנדיק דעם PSI-BLAST אַלגעריטם (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), ניצנדיק פעליקייט ווערטן פּאַראַמעטערס מיט די פאלגענדע קווערי פּראָטעין סיקוואַנסן: פון Bombyx mori (אַקסעסיע נומער NP_001038956.1), Musca domestica (אַקסעסיע נומער XP_005182020.1, XP_005175332.1 און XP_011294434.1) און Microplitis demolitor (אַקסעסיע נומער XP_008552646.1 און XP_008552645.1) EcK פון B. mori (אַקסעסיע נומער NP_001036900), Drosophila melanogaster (אַקסעסיע נומער NP_651202), Apis mellifera (אַקסעסיע נומער XP_394838) און Acyrthosiphon pisum (אַקסעסיע נומער XP_001947166); און EPP פון B. mori (אַקסעסיע נומער XP_001947166) NP_001177919.1 און NP_001243996.1) און EO פון D. melanogaster (אַקסעסיע נומער NP_572986.1) (טרעט 1). דערנאך, פילטערט טרעפערס באזירט אויף הויך mRNA אויסדרוק (>100 פראַגמענטן/קילאָבאַזע עקסאָנס פּער מיליאָן געמאַפּט רידס (FPKM) אָדער >85%) אין רעפּראָדוקטיווע געוועב (ווייַבלעך LRT אָדער MAG) אין גאַמביאַ (טרעט 2). כדי צו פֿאַרבעסערן ספּעציפֿישקייט, האָבן מיר אויסגעקליבן קאַנדידאַט ענזימען וואָס ווערן אויך אויסגעדריקט אין די רעפּראָדוקטיווע געוועבן פֿון A. albimanus, אַן אַנאָפֿעלעס מינים וואָס סינטעזירט אָדער טראַנספֿערירט נישט עקדיסאָן בעת ​​פּאָרעווען. קאַנדידאַט גענעס זענען פֿילטערירט געוואָרן באַזירט אויף נידעריק אויסדרוק (<100 FPKM אָדער <85סטער פּראָצענטיל) אין A. albimanus רעפּראָדוקטיווע געוועבן (טרעט 3). ווי אַ לעצטער פֿילטער (טרעט 4), דאַרפֿן קאַנדידאַט גענעס באַפֿרידיקן לפּחות איינע פֿון די פֿאָלגנדע: (1) באַדייטנד אַרויפֿגערעגולירט נאָך פּאָרעווען (P < 0.05) לויט דער אַנאַליז פֿון דיפֿערענציעל אויסגעדריקטע גענעס און (2) אין נישט-רעפּראָדוקטיווע געוועבן (< 85% אָדער <100 FPKM).
מיר האָבן מאָדיפֿיצירט פֿריִער באַשריבענע מעטאָדן 28,29,30 צו דערגרייכן גאַנץ-אָרגאַניזם איזאָטאָפּיש לייבאַלינג. אין קורצן, ווילד-טיפּ Saccharomyces cerevisiae טיפּ II (YSC2, Sigma) איז געווען טעסטעד אין הייוון ניטראָגען באַזע (BD Difco, DF0335) מיט (wt/vol) 2% גלוקאָזע (G7528, Sigma), 1.7% אַמינאָ זויער-פֿרייַ און אַמאָוניום סולפֿאַט. קולטור מעדיום) און 5% 15N אַמאָוניום סולפֿאַט (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ווי די איינציקע מקור פֿון ניטראָגען. הייוון איז געווען ריקאַווערד דורך סענטריפוגאַציע און מאַסקיטאָ לאַרוואַ זענען געפֿיטערט אַד ליביטום ביז פּופּאַציע. סופּלעמענט מיט פֿישמעל (0.5 מג פּער 300 לאַרוואַ) צו פאַרמייַדן פֿערטע אינסטאַר מאָרטאַליטי. בלויז ווייַבלעך זענען דעמאָלט געניצט אין פּאָרינג עקספּערימענטן מיט אַנלייבאַלד זכר צו אַנאַליזירן די זכר פּראָטעאָמע טראַנספֿערד בעשאַס פּאָרינג.
4-6 טעג אַלטע 15N-געטעגטע יונגפרויען זענען געצוואונגען געוואָרן צו פּאָרן זיך מיט עלטער-געפּאַסטע נישט-געטעגטע יונגפרויען זכרים. געראָטענע פּאָרונג איז וועריפיצירט געוואָרן דורך דעטעקטירן פּאָרונג פּלאַגז אונטער עפּיפלאָרעסענס מיקראָסקאָפּיע. ביי 3, 12, און 24 הפּם, די אַטריאַ פון 45-55 פּאָרטע ווייַבלעך זענען דיסעקטירט געוואָרן אין 50 µl פון אַמאָוניום ביקאַרבאָנאַט באַפער (pH 7.8) און כאָומאַדזשאַנייזד מיט אַ פּעסטלע. די כאָומאַדזשאַנייט איז סענטריפוגירט געוואָרן און די סופּערנאַטאַנט געמישט מיט 50 µl פון 0.1% RapiGest (186001860, וואָטערס) אין 50 mM אַמאָוניום ביקאַרבאָנאַט. די סופּערנאַטאַנט און פּעללעט פון יעדער מוסטער זענען סנאַפּ-פראָורנד אויף טרוקן אייז און געשיקט איבער נאַכט צו די מאַקקאָס לאַבאָראַטאָריע אין דער אוניווערסיטעט פון וואַשינגטאָן, וווּ מוסטער צוגרייטונג פֿאַר LC-MS/MS איז געענדיקט. רעסאַספּענד די פּעללעט אין 50 µl פון 0.1% RapiGest אין 50 mM אַמאָוניום ביקאַרבאָנאַט און סאָניקייט אין אַ וואַסער וואַנע. די פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן פון די פּעללעט און סופּערנאַטאַנט איז געמאסטן דורך די BCA טעסט, מוסטערן זענען רעדוצירט געוואָרן מיט 5 mM דיטהיאָטהרעיטאָל (DTT; Sigma), אַלקילירט מיט 15 mM יאָדאָאַסעטאַמיד (Sigma) און אינקובירט ביי 37 °C (1:0 50) פֿאַר 1 שעה מיט טריפּסיניזאַציע: טריפּסין:סאַבסטראַט פאַרהעלטעניש). ראַפּיגעסט איז געלייזט געוואָרן דורך צולייגן 200 mM HCl, נאכגעפאָלגט דורך אינקובאַציע ביי 37 °C פֿאַר 45 מינוט און צענטריפוגאַציע ביי 14,000 rpm פֿאַר 10 מינוט ביי 4 °C צו באַזייַטיקן דעבריס. מוסטערן זענען געוואַשן געוואָרן דורך דואַל-מאָד האַרט-פאַסע עקסטראַקציע (Oasis MCX קאַרטראַדזשאַז, וואָטערס) און ווידער-סוספּענדירט אין 0.1% פאָרמיק זויער פֿאַר אַ לעצט פּראָטעין קאָנצענטראַציע פון ​​0.33 µg µl-1. נישט-געמאַרקטע MAG פּראָטעאָמעס זענען ענלעך אַנאַליזירט געוואָרן פון יונגפרויען מענער. צוויי אַנאַליטישע רעפּליקאַטן זענען אַנאַליזירט געוואָרן פֿאַר יעדן מוסטער. דערנאָך, 1 µg פון יעדן איז אַנאַליזירט געוואָרן מיט אַ 25-cm פיוזד סיליקאַ 75-μm קאָלום מיט אַ 4-סענטימעטער געשמאָלצן סיליקאַ קאַסיל1 (PQ) פריט טראַפּ פּאַקט מיט דזשופּיטער C12 ריווערסט-פאַסע רעזין (פֿענאָמענעקס) און 180-מינוט פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע. מוסטער דיידזשעסטס – MS/MS איז געלאפן אויף א Q-Exactive HF מאסע ספעקטראמעטער (Thermo Fisher) מיט א nanoACQUITY UPLC סיסטעם (Waters). דאטן-פארבינדענע אקווייזישאן דאטן גענערירט פאר יעדן לויף זענען קאנווערטירט געווארן צו mzML פארמאט ניצנדיג Proteowizard (ווערסיע 3.0.20287) און ניצנדיג Comet31 (ווערסיע 3.2) קעגן די FASTA דאטאבאזע מיט פראטעין סיקווענסעס פון Anopheles gambiae (VectorBase ווערסיע 54), Anopheles coluzzi. א זוכעניש איז דורכגעפירט געווארן אויף Mali-NIH (VectorBase ווערסיע 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, מערץ 2021), A. gambiae RNA-seq, און דריי-פריים איבערזעצונגען פון באקאנטע מענטשלעכע קאנטאמינאנטן. פּעפּטייד מאַפּע-געמאכטע FDRs זענען באשטימט געווארן ניצנדיג Percolator32 (ווערסיע 3.05) מיט א שוועל פון 0.01, און פּעפּטיידן זענען צוזאמענגעשטעלט געווארן אין פראטעין אידענטיפיקאציעס ניצנדיג פראטעין פארסימאני אין Limelight33 (ווערסיע 2.2.0).רעלאַטיווע פּראָטעין שעפע איז געשאַצט געוואָרן ניצנדיק דעם נאָרמאַליזירטן ספּעקטראַלן שעפע פאַקטאָר (NSAF) קאַלקולירט פֿאַר יעדן פּראָטעין אין יעדן לויף ווי פריער באַשריבן.NSAF רעלאַטיוו צו יעדן פּראָטעין איז דורכשניטלעך געוואָרן אַריבער מוסטערן פון צוויי פֿאַרשידענע ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן.15N לייבאַלינג האָט געראָטן מאַסקטירן דעם ווייַבלעך פּראָטעאָם, כאָטש אַ קליינע מאָס פון אַנלייבאַלד פּראָטעין קען זיין דעטעקטעד פון די לייבאַלד יונגפרויען.מיר האָבן רעקאָרדירט ​​דעטעקציע פון ​​זכר פּראָטעין רעדוקציע (1-5 ספּעקטראַ) אין ווייַבלעך רויע מוסטערן בלויז אין טעכנישע לויפונגען, וווּ רויע מוסטערן זענען געלאָפן נאָך זכר/פּאָרונג מוסטערן, ווי אַ רעזולטאַט פון HPLC "קערי אָוווער".מאל פּראָטעאינען געפֿונען ווי 'קאַנטאַמאַנאַנץ' פון לייבאַלד יונגפרויען זענען ליסטעד אין סאַפּלעמענטאַרי טיש 1.
צוויי אַנטיגענישע פּעפּטיידן, QTTDRVAPAPDQQQ (אין איזאָטיפּ PA) און MESDGTTPSGDSEQ (אין איזאָטיפּ PA און PB) אין Genscript. די צוויי פּעפּטיידן זענען קאָמבינירט געוואָרן, דערנאָך קאָניוגירט צום טרעגער פּראָטעין KLH און אינדזשעקטירט אין ניו זילאַנד קיניגלעך. די קיניגלעך זענען געאָפפערט געוואָרן נאָך דער פערטער אינדזשעקשאַן, און גאַנץ IgG איז אפגעזונדערט געוואָרן דורך אַפיניטי רייניקונג. IgG פון דעם מערסט EPP-ספּעציפֿישן קיניגל איז געניצט געוואָרן פֿאַר ווייטערדיקע וועסטערן בלאָטינג.
פֿאַר וועסטערן בלאָטס, MAG (n = 10, וואו n רעפּרעזענטירט די צאָל ביאָלאָגיש אומאָפּהענגיקע מוסקיטאָ מוסטערן) און ווייַבלעך LRT (n = 30) פֿון 4-טאָג-אַלטע יונגפֿרױ זכרים און יונגפֿרױ אָדער געצוואונגענע ווייַבלעך (<10 נאָך-פּאָרונג), פּראָטעין עקסטראַקציע באַפֿער (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% נאַטריום דעאָקסיטשאָלאַט; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× פּראָטעאַזע אינהיביטאָר קאָקטייל (Roche)) איז צוגעגעבן געוואָרן באַזונדער. מוסטערן זענען האָמאָגעניזירט געוואָרן גלייך נאָך דיסעקציע מיט אַ בעאַדער (2 מם גלאָז קרעלן, 2,400 רפּם, 90 סעק). נישט-לייזלעכע דעבריס איז אַוועקגענומען געוואָרן דורך צענטריפוגאַציע ביי 20,000 ג ביי 4 °C. פּראָטעין זענען קוואַנטיפֿיצירט געוואָרן דורך בראַדפֿאָרד אַסיי (Bio-Rad). דערנאָך, 20 µg פון MAG פּראָטעין, 40 µg פון LRT פּראָטעין, און 20 µg פון רעשטלעך באַלק פּראָטעין זענען דענאַטורירט און אפגעשיידט געוואָרן דורך 10% Bis-Tris NuPAGE ניצנדיק MOPS באַפער. פּראָטעאינען זענען טראַנספערירט געוואָרן צו פּאָליווינילידען פלאָריד מעמבראַנעס ניצנדיק די iBlot2 טראַנספער סיסטעם (Thermo Fisher). מעמבראַנעס זענען געוואַשן געוואָרן צוויי מאָל אין 1× PBS-T (0.1% Tween-20 אין PBS) און דערנאָך בלאָקירט אין Odyssey בלאָקיר באַפער (Li-Cor) פֿאַר 1 שעה ביי 22°C. מעמבראַנעס זענען געשאָקלט געוואָרן איבער נאַכט ביי 4°C מיט קאַסטאַם קיניגל אַנטי-EPP פּאָליקלאָנאַל ערשטיק אַנטיבאָדי (1:700 אין בלאָקיר באַפער) און ראַץ אַנטי-אַקטין מאָנאָקלאָנאַל ערשטיק אַנטיבאָדי MAC237 (Abeam; 1:4,000). מעמבראַנעס זענען געוואַשן געוואָרן מיט PBS-T און דערנאָך אינקובירט מיט צווייטיקע אַנטיבאָדיעס (אייזל אַנטי-קיניגל 800CW און ציג אַנטי-ראַץ 680LT (Li-Cor), ביידע 1:20,000) אין בלאָקיר באַפער מיט 0.01% SDS און 0.2% Tween -20 פֿאַר 1 שעה ביי 22 °C. מעמבראַנען זענען געוואַשן געוואָרן מיט PBS-T און געמאַכט בילדער מיט אַן Odyssey CLx סקאַנער. בילדער זענען געזאַמלט און פּראַסעסט אין Image Studio (ווערסיע 5.2). אַ ספּעציפֿישער באַנד וואָס קאָרעספּאָנדירט צו דער EPP-RA יסאָפאָרם (82 kDa) איז נישט דעטעקטירט געוואָרן.
די קאָדירנדיקע געגנטן פון EPP (ווי איזאָפאָרם AGAP002463-RB וואָס ענטהאַלט היסטידין פאָספאַטאַז דאָמעין, NCBI קאָנסערווירט דאָמעין זוכן 34) און EcK2 (AGAP002181) זענען געווען קלאָנירט אין pET-21a(+) פּלאַזמיד (נאָוואַגען מיליפּאָרע סיגמאַ); פריימערס זענען ליסטעד אין עקסטענדעד דאטן טאבעלע 2. אכט GS4 לינקערס (אין טאנדעם) זענען אריינגעשטעלט געווארן פארן C-טערמינאל 6xHis טעג פון דעם pET-21a(+)-EcK2 קאנסטרוקט. רעקאמבינאנט פראטעאינען זענען פראדוצירט געווארן ניצנדיג די NEBExpress צעל-פרייע E. coli פראטעין סינטעז רעאקציע (New England BioLabs). רעקאמבינאנט פראטעאינען זענען גערייניקט געווארן ניצנדיג NEBExpress Ni ספּין קאלום'ס (New England BioLabs). דיהידראפאלאט רעדוקטאזע (DHFR) קאנטראל פראטעין איז פראדוצירט געווארן ניצנדיג DNA טעמפלאט פון דעם NEBExpress צעל-פרייע E. coli פראטעין סינטעז קיט. פראטעאינען זענען געהאלטן געווארן אין 50% גליסערין אין PBS ביי -20 °C פאר ביז 3 חדשים.
פאָספֿאַטאַזע אַקטיוויטעט פֿון EPP און געוועב עקסטראַקטן איז געמאָסטן געוואָרן מיט 4-ניטראָפֿעניל פאָספֿאַט (pNPP; Sigma-Aldrich). דער רעאַקציע באַפֿער האָט ענטהאַלטן 25 mM טריס, 50 mM עסיק זויער, 25 mM ביס-טריס, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, און 1 mM DTT. געוועב איז האָמאָגעניזירט געוואָרן אין רעאַקציע באַפֿער און צעל דעבריס איז אַוועקגענומען געוואָרן דורך צענטריפוגאַציע. אָנהייבן די רעאַקציע דורך צולייגן ענזיים אָדער געוועב עקסטראַקט צו רעאַקציע באַפֿער וואָס ענטהאַלט 2.5 מג מל-1 pNPP. די רעאַקציע געמיש איז אינקובירט געוואָרן ביי צימער טעמפּעראַטור אין דער פֿינצטערניש, און די סומע פֿון pNP קאָנווערטירט פֿון pNPP איז קוואַנטיפֿיצירט געוואָרן דורך מעסטן די אַבסאָרבאַנס ביי 405 נם אין פֿאַרשידענע צייטן.
פֿאַר אין וויטראָ EcK אַקטיוויטעט, איז דער פּראָטעין אינקובירט געוואָרן מיט 0.2 מג 20E אָדער 3D20E אין 200 µl באַפער (pH 7.5) וואָס האָט ענטהאַלטן 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP און 10 mM MgCl2 פֿאַר 2 שעה ביי 27 °C. די רעאַקציע איז אָפּגעשטעלט געוואָרן דורך צולייגן 800 µl מעטאַנאָל, דערנאָך אָפּגעקילט ביי -20 °C פֿאַר 1 שעה, און דערנאָך צענטריפוגירט ביי 20,000 g פֿאַר 10 מינוט ביי 4 °C. דער סופּערנאַטאַנט איז דערנאָך אַנאַליזירט געוואָרן דורך HPLC-MS/MS. כּדי צו היץ-אינאַקטיווירן די פּראָטעאינען געניצט אין דער קאָנטראָל גרופּע, זענען די פּראָטעאינען אינקובירט געוואָרן אין 50% גליסערין אין PBS פֿאַר 20 מינוט ביי 95°C.
פֿאַר אין וויטראָ EPP אַקטיוויטעט, איז דער פּראָטעין אינקובירט געוואָרן מיט 3D20E22P (עקוויוואַלענט צו דער סומע געפֿונען אין 18 פּאָר MAG, פּיוראַפייד דורך HPLC-MS/MS) אין 100 µl באַפער (pH 7.5) מיט 25 mM טריס, 50 mM עסיק זויער, 25 mM ביס-טריס, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, און 1 mM DTT פֿאַר 3 שעה ביי 27 °C. די רעאַקציע איז אָפּגעשטעלט געוואָרן דורך צולייגן 400 µl מעטאַנאָל און אָפּגעקילט ביי -20 °C פֿאַר 1 שעה, און דערנאָך סענטריפוגירט ביי 20,000 g פֿאַר 10 מינוט ביי 4 °C. דער סופּערנאַטאַנט איז אַנאַליזירט געוואָרן דורך HPLC-MS/MS.
PCR פראגמענטן פאר EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) און EcK2 (556 bp) זענען געווארן אמפליפירט פון cDNA צוגעגרייט פון געמישט-געשלעכט קעפלאזע מוסקיט קאדאַווערן. דער PCR פראגמענט פון דער eGFP קאנטראל (495 bp) איז געווארן אמפליפירט פון דעם פריער באשריבענע pCR2.1-eGFP; PCR פריימערס זענען ליסטעד אין עקסטענדעד דאטן טאבעלע 2. דער PCR פראגמענט איז געווארן אריינגעשטעלט צווישן די אינווערטירטע T7 פראמאטארן אויף דעם pL4440 פלאזמיד. פלאזמיד קאנסטרוקציעס זענען צוריקגעכאפט געווארן פון NEB 5-α קאמפעטענטע E. coli (ניו ענגלאנד ביאלאבס) און וועריפיצירט דורך DNA סיקווענסינג פאר באנוץ (זעה סופּלעמענטאַרי דאטן 1 פאר אריינשטעק סיקווענס). פריימערס וואס זענען געפאסט צום T7 פראמאטאר (עקסטענדעד דאטן טאבעלע 2) זענען גענוצט געווארן צו פארגרעסערן דעם אריינשטעק פון דעם pL4440-באזירטן פלאזמיד. PCR פראדוקט גרייס איז באשטעטיקט געווארן דורך אגאראוז געל עלעקטראפארעזיס. dsRNA איז געווארן טראַנסקריבירט פון PCR טעמפלעיטס ניצנדיג דעם מעגאסקריפּט T7 טראַנסקריפּציע קיט (טהערמאָ פישער) און גערייניקט לויט די אינסטרוקציעס פונעם פאבריקאנט מיט די מאדיפיקאציעס וואס זענען פריער באשריבן געווארן.
פֿאַר dsRNA אינדזשעקציע, איז 1,380 ng פון dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) אינדזשעקטירט געוואָרן אין אַ קאָנצענטראַציע פון ​​10 ng nl-1 אין דעם ברוסטקאַסטן פון דערוואַקסענע מענער אָדער פרויען (Nanoject III, Drummond) אין 1 טאָג נאָך עקלאָוזשאַן. גענע נאַקדאַון לעוועלס זענען באַשטימט געוואָרן אין לפּחות דריי ביאָלאָגישע רעפּליקאַטעס דורך RNA עקסטראַקציע, cDNA סינטעז, און RT-qPCR. פֿאַר עקדיסאָן אינדזשעקציע, זענען 4-טאָג-אַלטע יונגפרויען אָדער 6-טאָג-אַלטע יונגפרויען בלוט-געפֿיטערטע פרויען אינדזשעקטירט געוואָרן מיט 0.13, 0.21, אָדער 0.63 µg פון 20E אָדער 3D20E (Nanoject III, Drummond) אין קאָנצענטראַציעס פון 1.3, 2.1, ריספּעקטיוולי, דיפּענדינג אויף די עקספּערימענטאַלע פּלאַן אָדער 6.3 ng nl-1. אינדזשעקטירט 100 nl פון 10% (vol/vol) עטאַנאָל אין וואַסער; 100 נול פון 3D20E22P אין 10% עטאַנאָל (עקוויוואַלענט צו 75% פון דער סומע געפֿונען אין אַ פּאָר MAGs). מאַסקיטאָס זענען ראַנדאָם צוגעטיילט געוואָרן צו דער ינדזשעקשאַן גרופּע.
פֿאַר שפּייַען אַסייז, 3-טאָג-אַלטע ווייַבלעך זענען געפֿיטערט געוואָרן אַד ליביטום אויף מענטשלעך בלוט. אַראָפּנעמען טיילווייז געפֿיטערט אָדער נישט געפֿיטערט מאַסקיטאָס. דעפּענדינג אויף די באַהאַנדלונג, ווייַבלעך זענען געשטעלט געוואָרן אין באַזונדער שפּייַען טעפּלעך פֿאַר פֿיר נעכט לפּחות 48 שעה נאָך די בלוט מאָלצייַט. אייער זענען געציילט געוואָרן אונטער אַ סטערעאָסקאָפּ (סטעמי 508, זייס); פֿאַר געפּאָרטע ווייַבלעך, אייער וואָס האָבן אויסגעבראָטן אין לאַרוואַ זענען גערעכנט געוואָרן ווי פרוכטבאַר.
פאר פארפארונג טרייעלס, האט מען די נקבות געגעבן לפחות 2 טעג, לויט די באהאנדלונג, צו אנטוויקלען קעגנשטעל קעגן פארפארונג, און ווילד-טיפ עלטער-געפאסטע זכרים זענען דערנאך אריינגעפירט געווארן אין דעם זעלבן שטעג. צוויי נעכט שפעטער, זענען די נקבות פערטיליזירטע וועסיקלעס דיסעקטירט געווארן און גענאמישע דנאַ איז באפרייט געווארן דורך איינפרירן-אויפטויען און סאניקאציע אין א באַפער מיט 10 mM טריס-HCl, 1 mM EDTA, און 25 mM NaCl (pH 8.2). מוסטערן זענען אינקובירט געווארן מיט פּראָטעאינאזע K (0.86 µg µl-1) פאר 15 מינוט ביי 55 °C, נאכגעפאלגט דורך 10 מינוט ביי 95 °C. רויע גענאמישע דנאַ פּרעפּעריישאַנז זענען פארדיןנט 10-פאַך און אונטערגעוואָרפן צו qPCR דעטעקציע פון ​​Y כראָמאָסאָם סיקוואַנסן; פּריימערס זענען ליסטעד אין עקסטענדעד דאַטאַ טיש 2. אַוועק פון Y כראָמאָסאָם סיקוואַנס ינדיקייץ קיין פארפארונג.
פאר ווידער-פארפּאָרונג פּרובירן, זענען געצוואונגענע ווייַבלעך געפּrüפֿט געוואָרן אויף דער אנוועזנהייט פון פּאָרונג פּלאַגז צו באַשטעטיקן דעם פּאָרונג סטאַטוס און האָבן דערלויבט 2 טעג צו אַנטוויקלען רעפראַקטאָרינעס צו פּאָרונג אין דער אַוועק פון זכרים, ווי פריער באַשריבן 36. זכרים וואָס טראָגן DsRed טראַנסגעניק זיירע זענען דעמאָלט איינגעפירט געוואָרן אין ווייַבלעך קאַגעס. צוויי נעכט שפּעטער, זענען די פערטילייזינג וועסיקלעס דיסעקטירט געוואָרן פון די ווייַבלעך, און גענאָמיש דנאַ איז צוגעגרייט געוואָרן ווי באַשריבן אויבן און אונטערגעוואָרפן צו qPCR דעטעקציע פון ​​די DsRed טראַנסגענע; פּריימערס זענען ליסטעד אין עקסטענדעד דאַטאַ טיש 2. די אַוועק פון די DsRed טראַנסגענע האט געוויזן אַז קיין ווידער-פארונג איז נישט פארגעקומען.
3D20E איז סינטעזירט געוואָרן ווי פריער באַשריבן 37. אין קורצן, 10 מג פון 20E (Sigma-Aldrich) איז אויפגעלייזט געוואָרן אין 10 מל וואַסער, און דערנאָך איז צוגעגעבן געוואָרן 30 מג פּלאַטינום שוואַרץ (אין פּודער פֿאָרעם, Sigma-Aldrich). א זאַפֿטיקער שטראָם פון O2 איז קאָנטינויִערלעך אַרײַנגעבלאָזן געוואָרן אין דער רעאַקציע געמיש, וואָס איז גערודערט געוואָרן בײַ צימער טעמפּעראַטור. נאָך 6 שעה, איז צוגעגעבן געוואָרן 30 מל מעטאַנאָל צו אָפּשטעלן די רעאַקציע. די געמיש איז צענטריפוגירט געוואָרן צו באַזײַטיקן קאַטאַליסט פּאַרטיקלען. דער סופּערנאַטאַנט איז פֿאַרדאַמפּט געוואָרן ביז טרוקן אין וואַקוום בײַ צימער טעמפּעראַטור. דער געטריקנטער רעאַקציע פּראָדוקט איז אויפגעלייזט געוואָרן אין 10% עטאַנאָל און מעטאַנאָל פֿאַר אינדזשעקשאַן פֿאַר HPLC-MS/MS אַנאַליז. די קאָנווערסיע קורס (פון 20E צו 3D20E) איז געווען אַרום 97% (פיגור 4ב), און דער MS ספּעקטרום פון דעם סינטעזירטן 3D20E האָט זיך געפּאַסט צו דעם וואָס איז געפֿונען געוואָרן אין געפּאָרטע נקבות (פיגור 4ג).
די לעגענדע אנטהאלט ספעציפישע פרטים פון די סטאטיסטישע טעסטס וואס זענען דורכגעפירט געווארן. גראפפאד (ווערסיע 9.0) איז גענוצט געווארן צו דורכפירן פישער'ס עקזאקטער טעסט, מענטל-קאקס טעסט, און סטודענט'ס ט-טעסט. קאכראן-מענטל-הענצל טעסטס זענען דורכגעפירט געווארן מיט א אייגענעם R סקריפט (פארהאן ביי https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). די דאטן פארטיילונג איז געטעסט געווארן פאר נארמאליטעט מיטן שאפירא-ווילק טעסט מיט א באדייטונגס שוועל פון 0.05. ווען די דאטן האבן נישט דורכגעפאלן דעם נארמאליטעט טעסט, איז דער מאן-וויטני טעסט דורכגעפירט געווארן. איבערלעבונג דאטן זענען אנאליזירט געווארן מיטן מענטל-קאקס טעסט. דער DESeq2 פעקל (ווערסיע 1.28.1) איז גענוצט געווארן צו דורכפירן RNA-seq גען-לעוועל דיפערענציעל אויסדרוק אנאליז. דער האריזאנטאלער באר אויפן גראף רעפרעזענטירט דעם מעדיאן. א באדייטונגס ווערט פון P = 0.05 איז גענוצט געווארן אלס דער שוועל פאר אלע טעסטס.
פֿאַר מער אינפֿאָרמאַציע וועגן דעם שטודיע־פּלאַן, זעט דעם אַבסטראַקט פֿון Nature Research Report וואָס איז פֿאַרבונדן מיט דעם אַרטיקל.
MS פּראָטעאָמישע דאַטן זענען דעפּאַזיטיד אין די ProteomeXchange קאָנסאָרטיום (http://proteomecentral.proteomexchange.org) דורך די PRIDE פּאַרטנער רעפּאָזיטאָרי (https://www.ebi.ac.uk/pride/) מיטן דאַטאַסעט אידענטיפיצירער PXD032157.
די RNA-seq דאַטאַסעט איז דעפּאַזיטירט אין דער Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) אונטער דער סעריאַל רעקאָרד GSE198665.
נאָך דאַטאַסעץ וואָס זענען גענערירט און/אָדער אַנאַליזירט געוואָרן בעת ​​דער איצטיקער שטודיע קענען באַקומען ווערן פון די קאָרעספּאָנדירנדיקע מחברים אויף אַ גלייכבארע בקשה. דער אַרטיקל גיט די מקור דאַטן.
דע לוף, א. עקדיסטערוידן: פארנאכלעסיגטע אינסעקט סעקס סטערוידן? זכר: בלעק באקס. אינסעקט סייענס. 13, 325–338 (2006).
רעדפֿערן, CPF 20-הידראָקסיעקדיסאָן און אָוואַריאַן אַנטוויקלונג אין אַנאָפֿעלעס סטיפֿענס. דזש. אינסעקט פֿיזיאָלאָגיע. 28, 97–109 (1982).