פּראָטעין סאָרטינג אין דעם סעקרעטאָרישן וועג איז עסענציעל פֿאַר אויפהאַלטן צעל קאָמפּאַרטמענטאַליזאַציע און האָמעאָסטאַסיס. אין דערצו צו שאָל-מעדיאַטעד סאָרטינג, די ראָלע פון ​​ליפּידן אין קינעזין סאָרטינג אין דעם פּראָצעס פון סעקרעטאָרישן טראַנספּאָרט איז אַ לאַנג-שטייענדיקע גרונטלעכע קשיא וואָס איז נאָך נישט געענטפערט געוואָרן. דאָ, מיר דורכפירן 3D סיימאַלטייניאַס מולטיקאָליר הויך-רעזאָלוציע רעאַל-צייט ימאַגינג צו באַווייַזן אין וויוואָ אַז ניי סינטעזירטע גליקאָסילפאָספאַטידילינאָסיטאָל-ימאָובאַלייזד פּראָטעאינען מיט זייער לאַנגע סעראַמיד ליפּיד מאָיעטיס זענען קלאַסטערד און קלאַסיפיצירט אין ספּעשאַלייזד ענדאָפּלאַזמען נעץ אַרויסגאַנג פּלאַץ, וואָס איז אַנדערש פון דעם געניצט דורך טראַנסמעמבראַנע פּראָטעאינען. אין דערצו, מיר ווייַזן אַז די קייט לענג פון סעראַמיד אין די ענדאָפּלאַזמיק רעטיקולום מעמבראַנע איז קריטיש פֿאַר דעם סאָרטינג סעלעקטיוויטי. אונדזער שטודיע גיט די ערשטע דירעקט אין וויוואָ באַווייַזן צו קלאַסיפיצירן פּראָטעין לאַסטאָוז באזירט אויף ליפּיד קייט לענג אין סעלעקטיוו עקספּאָרט זייטלעך אין דעם סעקרעטאָרישן וועג.
אין עוקאַריאָטישע צעלן, די פּראָטעאינען סינטעזירט אין די ענדאָפּלאַזמישע רעטיקולום (ER) ווערן דאַן סאָרטירט בעת טראַנספּאָרט דורך די סעקרעטאָרישע וועג פֿאַר עקספּרעס צו זייער פּאַסיק צעלולאַרע דעסטינאַציע (1). אין דערצו צו מאַנטל-מעדיאַטעד סאָרטינג, איז לאַנג ספּעקולירט געוואָרן אַז געוויסע ליפּידן קענען אויך דינען ווי סעלעקטיווע אַרויסגאַנג פונקטן דורך קלאַסטערינג זיי אין ספּעציפֿישע מעמבראַן דאָמעינען וואָס ספּעציפֿיש פּראָטעאינען (2-5). אָבער, עס איז נאָך אַ מאַנגל פון דירעקט אין וויוואָ באַווייַזן צו באַווייַזן דעם מעגלעך ליפּיד-באַזירט מעקאַניזאַם. כּדי צו סאָלווע דעם גרונט פּראָבלעם, האָבן מיר שטודירט אין הייוון ווי גליקאָסילפאָספאַטידילינאָסיטאָל (GPI) אַנגקערד פּראָטעאינען (GPI-APs) ווערן דיפערענטשאַלי עקספּאָרטירט פון די ER. GPI-APs זענען אַ פאַרשיידנקייַט פון ליפּיד-פארבונדענע צעל ייבערפלאַך פּראָטעאינען (6, 7). GPI-AP איז אַ סעקרעטעד פּראָטעין אַטאַטשט צו די ויסווייניקסטע בלעטלעך פון די פּלאַזמע מעמבראַן דורך די גליקאָליפּיד מאָיעטי (GPI אַנקער). זיי אָננעמען GPI אַנקערז ווי קאָנסערוואַטיווע פּאָסט-טראַנסלאַציאָנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס אין די ER לומען (8). נאך זיך אנצושליסן, גייט GPI-AP אדורך דעם גאלדזשי אפאראט (5, 9) פונעם ER צו דער פלאזמע מעמבראן. די אנוועזנהייט פון GPI אנקערס פירט צו דעם אז GPI-AP זאל ווערן טראנספארטירט באזונדער פון טראנסמעמבראן סעקרעטירטע פראטעאינען (אריינגערעכנט אנדערע פלאזמע מעמבראן פראטעאינען) צוזאמען דעם סעקרעטארישן וועג (5, 9, 10). אין הייוון צעלן, ווערן GPI-APs אפגעטיילט פון אנדערע סעקרעטירטע פראטעאינען אין דעם ענדאפלאזמישן רעטיקולום, און דערנאך פארפאקט אין אייגנארטיגע וועסיקלען איינגעוויקלט דורך קאטן פראטעין קאמפלעקס II (COPII) (6, 7). די דעטערמינאנטן פון דעם קלאסיפיקאציע פראצעס אין דעם ER עקספארט פראצעס זענען נישט קלאר, אבער מען ספעקולירט אז דער מעכאניזם קען פארלאנגען ליפידן, ספעציעל די סטרוקטורעלע רעמאדעלינג פון דעם ליפיד טייל פונעם GPI אנקער (5, 8). אין הייוון, הייבט זיך אן GPI ליפיד רעמאדעלינג גלייך נאכדעם וואס דער GPI באפעסטיגט זיך, און אין פילע פעלער, פירט עס צו דעם אז סעראַמיד זאל זיך בינדן צו דער 26-קארבאן לאנג-קייט געזעטיקטער פעטי זויער (C26:0) (11, 12). C26 סעראַמיד איז דער הויפּט סעראַמיד וואָס ווערט ביז איצט פּראָדוצירט דורך הייוון צעלן. עס ווערט סינטעזירט אין דעם ER און רובֿ דערפון ווערט עקספּאָרטירט צום גאָלדזשי אַפּאַראַט דורך COPII וועסיקלעס (13). דער ER עקספּאָרט פון GPI-AP ריקווייערז ספּעציפֿיש אָנגאָינג סעראַמיד סינטעז (14, 15), און אין דער ריי, די קאָנווערסיע פון ​​סעראַמיד צו ינאָסיטאָל פאָספֿאַט סעראַמיד (IPC) אין דעם גאָלדזשי אַפּאַראַט דעפּענדס אויף GPI אַנקער סינטעז (16). ביאָפֿיזיקאַלישע שטודיעס מיט קינסטלעכע מעמבראַנעס האָבן געוויזן אַז זייער לאַנגע אַסיל קייט סעראַמידעס קענען קאָאַלעסירן צו פֿאָרמירן אָרדערד דאָומיינז מיט יינציק פֿיזיקאַלישע פּראָפּערטיעס (17, 18). די דאַטן פֿירן צו דער היפּאָטעזע אַז C26 סעראַמיד און GPI-AP מיט C26 סעראַמיד נוצן זייערע פֿיזיקאַלישע פּראָפּערטיעס צו קאָאַלעסירן אין אָרדערדיקע געגנטן אָדער געגנטן אין דער רעלאַטיוו כאַאָטישער ER מעמבראַנע ליפּיד סביבה. עס איז דער הויפּט צוזאַמענגעשטעלט פון קורצע און אַנסאַטשערייטיד גליסעראָליפּידן (C16:1 און C18:1) (19, 20). די געגנטן וועלן סעלעקטיוו פאָקוסירט ווערן אויף ספּעציפֿישע ER אַרויסגאַנג זייטלעך (ERES), וואו סעראַמיד און סעראַמיד-באַזירט GPI-AP קענען קאָ-טראַנספּאָרטירט ווערן צום גאָלדזשי אין דער זעלבער דעדיקירטער COPII וועסיקל (5).
אין דעם שטודיע, האָבן מיר דירעקט געטעסט דעם ליפּיד-באַזירטן מעכאַניזם דורך ניצן סופּער-רעזאָלוציע קאָנפאָקאַל רעאַל-צייט בילדגעבונג מיקראָסקאָפּיע (SCLIM), וואָס איז אַ שניידנדיקע מיקראָסקאָפּיע טעכניק וואָס קען סיימאַלטייניאַסלי אָבסערווירן פלורעסענטלי מאַרקירטע פּראָטעאינען. די דריי-קאָליר און דריי-דימענסיאָנאַלע (3D) בילדער האָבן גאָר הויכע רעזאָלוציע און גיכקייט אין לעבעדיקע צעלן (21, 22).
מיר האָבן ערשט אָנגעווענדט SCLIM טעכנאָלאָגיע צו ווייטער דעפינירן ווי נאָרמאַל GPI-AP מיט C26 סעראַמיד גרופּע איז געוואָרן געסקרינט פֿון טראַנסמעמבראַנע סעקרעטירטע פּראָטעאינען נאָך פֿאַרלאָזן דעם ER אין S. cerevisiae. כּדי צו קאָנטראָלירן די קלאַסיפֿיקאַציע פֿון ER, האָבן מיר גענוצט אַ גענעטישע סיסטעם וואָס קען גלייך וויזואַליזירן ניי סינטעזירטע לאַסט וואָס גייט אַרײַן אין ERES אין וויוואָ (7, 23). ווי לאַסט, האָבן מיר אויסגעקליבן C26 סעראַמיד-באַזירט GPI-AP Gas1 באַצייכנט מיט גרין פֿלורעסצענט פּראָטעין (GFP) און טראַנסמעמבראַנע סעקרעטירטע פּראָטעין Mid2 באַצייכנט מיט נאָענט-אינפֿראַרויט פֿלורעסצענט פּראָטעין (iRFP), ביידע פֿון וועלכע צילן די פּלאַזמע מעמבראַנע (24-26). אין דעם sec31-1 טעמפּעראַטור-סענסיטיוו מוטאַנט, ווערן די צוויי לאַסט אויסגעדריקט אונטער אַ גאַלאַקטאָז-ינדוסיבלע פּראָמאָטער און אַ קאָנסטיטוטיוו ERES מאַרקער. בײַ דער עקסטרעמער טעמפּעראַטור (37°C), ווײַל די sec31-1 מוטאַציע אַפֿעקטירט די פֿונקציע פֿון COPII מאַנטל קאָמפּאָנענט Sec31 צו פֿאַרהיטן COPII דזשערמאַניישאַן און ER עקספּאָרט, אַקיומיאַלירט זיך ניי סינטעזירטע לאַסט בײַם ER (23). נאך קילן צו א נידעריגע טעמפעראטור (24°C), האבן זיך די sec31-1 מוטאנט צעלן ערהוילט פון דעם סעקרעטארישן געגנט, און די אנגעזאמלטע נייע סינטעטישע לאסט האט אנגעהויבן צו ווערן עקספארטירט פון דעם ER. CLIM וויזואליזאציע האט געוויזן אז רוב פון די ניי סינטעזירטע Gas1-GFP און Mid2-iRFP האבן זיך נאך אלץ אנגעזאמלט אין דעם ER פון די sec31-1 מוטאנט צעלן נאך אינקובאציע ביי 37°C און דערנאך באפרייט ביי 24°C פאר 5 מינוט (פיגור 1). ווייל Mid2-iRFP איז פארשפרייט אויף דער גאנצער ER מעמבראן, און Gas1-GFP איז קאנצענטרירט און געזאמלט אין דעם אומקאנטיניועזן ER מעמבראן געגנט, איז זייער פארשפרייטונג אינגאנצן אנדערש (פיגור 1, A ביז C און פילם S1). דערצו, ווי געוויזן אין פיגור 1D, האט דער Gas1-GFP קלאסטער נישט Mid2-iRFP. די רעזולטאטן ווייזן אז GPI-AP און טראנסמעמבראן פראטעאינען זענען פרי אפגעטיילט געווארן אין פארשידענע ER מעמבראן געגנטן. דער Gas1-GFP קלאַסטער איז נעבן אַ ספּעציפֿישן ERES וואָס איז באַצייכנט מיט mCherry'ס COPII מאַנטל פּראָטעין Sec13 (פֿיגור 1, E און F, און פֿילם S1) (23).
sec31-1 צעלן אויסדריקן גאַלאַקטאָז-אינדוצירטע סעקרעציעס, אַ לאַנגע אַסיל קייט (C26) סעראַמיד GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, גרין) און די טראַנסמעמבראַנע פּראָטעין Mid2-iRFP (TMP, בלוי) און דעם קאָנסטרוקטיווע ERES לייבאַלינג Sec13-mCherry (ERES, מאַגענטאַ) איז געווען אינקובירט ביי 37°C פֿאַר 30 מינוט, באַוועגט צו 24°C, און ימאַגד דורך SCLIM 5 מינוט שפּעטער. (A צו C) ווייזט אַ רעפּרעזענטאַטיוו צונויפגעמישט אָדער איין 2D בילד פון אַ פלאַך (A), אַ 2D פּראָיעקציע בילד פון 10 z-סעקשאַנז (B) אָדער אַ 3D צעל האַלבקוגל בילד פון לאַסט און ERES מאַרקערס (C). סקאַלע באַר 1μm (A און B). די סקאַלע אַפּאַראַט איז 0.551μm (C). Gas1-GFP איז געווען דעטעקטעד אין דיסקרעטע ER מקומות אָדער קלאַסטערס, בשעת Mid2-iRFP איז געווען דעטעקטעד און פאַרשפּרייט איבער די ER מעמבראַנע (C). (ד) די גראַפיק ווייזט די רעלאַטיווע פלואָרעסצענץ אינטענסיטעט פון Gas1-GFP און Mid2-iRFP אין די Gas1-GFP קלאַסטער צוזאמען די ווייסע פייַל ליניע (לינקס). AU, אַרביטרערע איינהייט. (E און F) רעפּרעזענטירן די 3D בילד וואָס קאָמבינירט די סחורות און ERES צייכן. Gas1-GFP קלאַסטערס זענען דעטעקטירט געוואָרן לעבן די ספּעציפֿישע ERES. די וואָג איינהייט איז 0.551μm. (F) דער ווייסער האַרטער פייַל מאַרקירט די Gas1-GFP קלאַסטער פֿאַרבונדן מיט ERES. די מיטל און רעכט פּאַנאַלז ווייַזן די צוזאַמענגעפֿאַסטע פֿאַרגרעסערטע 3D בילד און אַ ראָטירט מיינונג פון די אויסגעקליבענע Gas1-GFP קלאַסטער.
די נאָענטע ספּיישאַל באַציִונג צווישן דעם Gas1-GFP קלאַסטער און אַ ספּעציפֿישן ERES ווײַזט אָן אַז Gas1-GFP קען אַרײַנגיין אין סעלעקטיוון ERES, וואָס איז אַנדערש פֿון דער סעלעקטיוויטעט געניצט דורך Mid2-iRFP צו פֿאַרלאָזן דעם ER. כּדי צו אַדרעסירן דעם מעגלעכקייט, האָבן מיר קוואַנטיפֿיצירט דעם ERES פאַרהעלטעניש פֿאַר בלויז איין אָדער צוויי סחורות (פֿיגור 2, A ביז C). מיר האָבן געפֿונען אַז רובֿ ERES (70%) אַנטהאַלטן בלויז איין טיפּ לאַסט. די אונטערשטע בילד פֿון פֿיגור 2C ווײַזט צוויי טיפּישע בײַשפּילן פֿון ERES מיט בלויז Gas1-GFP (פֿיגור 1) אָדער בלויז Mid2-iRFP (פֿיגור 2). אין קאָנטראַסט, אַרום 20% פֿון ERES אַנטהאַלטן צוויי לאַסט וואָס אָוווערלאַפּן זיך אין דער זעלבער געגנט. עס איז געפֿונען געוואָרן אַז עטלעכע ERES (10%) אַנטהאַלטן צוויי טיפּן לאַסט, אָבער זיי זענען געווען אפגעזונדערט אין קלאָר אַנדערע געביטן. דעריבער, ווײַזט די סטאַטיסטישע אַנאַליז אַז נאָכדעם ווי דער ER ווערט עקספּאָרטירט, זענען GPI-AP Gas1-GFP און די טראַנסמעמבראַנע לאַסט Mid2-iRFP צעטיילט אין אַנדערע ERES (פֿיגור 2D). די סאָרטירונג עפעקטיווקייט איז זייער קאָנסיסטענט מיט דער פריערדיקער ביאָכעמישער אַנאַליז (6) און מאָרפאָלאָגישער באַשטימונג (7). מיר קענען אויך באַאָבאַכטן דאָס נאַטור פון דער קוואַראַנטינירטער לאַסט וואָס גייט אַרײַן אין ERES (פיגור 2E און פֿילם S2). פיגור 2E ווײַזט אַז נאָר אַ קליין טייל פון Gas1-GFP (פּאַנעל 3) אָדער Mid2-iRFP (פּאַנעל 4) גייט אַרײַן אין דער ERES פֿון איין זײַט און איז באַגרענעצט אין אַ באַזונדערן געגנט. פּאַנעל 5 פֿון פיגור 2E ווײַזט אַז Gas1-GFP און Mid2-iRFP ווערן מאַנטשמאָל געפֿונען אין דער זעלבער ERES, אָבער זיי גייען אַרײַן פֿון פֿאַרשידענע זײַטן און זענען קאָנצענטרירט אין באַזונדערע געגנטן וואָס קענען רעפּרעזענטירן פֿאַרשידענע COPII וועסיקלעס. מיר האָבן אויך באַשטעטיקט אַז די באַאָבאַכטע צעשיידונג און קלאַסיפֿיקאַציע פֿון C26 סעראַמיד-באַזירט GPI-AP Gas1 ווי סעלעקטיוו ERES איז ספּעציפֿיש ווײַל אַן אַנדער טראַנסמעמבראַנע סעקרעציע לאַסט, די GFP-געטאַגד פּלאַזמע מעמבראַנע פּראָטעין Axl2 (27), ווײַזט ענלעך נאַטור צו Mid2-iRFP. (בילד S1 און פֿילם S3). די ניי סינטעזירטע Axl2-GFP ווערט פארשפרייט דורך די ER מעמבראַנע ווי Mid2-iRFP (פיגור S1, A און B), און איז קאָ-לאָקאַליזירט מיט Mid2-iRFP אין רובֿ ERES (פיגור S1, B ביז D). פּאַנעלן 1 און 2 פון פיגור 1. S1C ווײַזן צוויי טיפּישע ביישפילן פון ERES וואו צוויי טראַנסמעמבראַנע לאַסטן אָוווערלאַפּן זיך. אין די פאַלן, גייען ביידע סחורות אַרײַן אין ERES צוזאַמען (פיגור S1E, פּאַנעל 3 און פֿילם S3).
די sec31-1 צעלן וואָס אויסדריקן גאַלאַקטאָז אינדוצירבארע סעקרעציעס, Gas1-GFP (GPI-AP, גרין) און Mid2-iRFP (TMP, בלוי) און קאָנסטיטוטיוו ERES לייבאַלינג Sec13-mCherry (ERES, מאַגענטאַ) זענען געשטעלט געוואָרן ביי 37. נאָך אינקובירן פֿאַר 30 מינוט ביי °C, אַריבערגיין צו 24 °C צו באַפרייען דעם סעקרעציע בלאָק, און בילד מיט SCLIM נאָך 20 מינוט. (A ביז C) רעפּרעזענטאַטיווע 2D פּראָיעקציע בילדער (A; סקאַלע באַר, 1μm) אָדער 3D צעל האַלבקוגל בילדער (B און C; סקאַלע אַפּאַראַט, 0.456μm) פון די לאַסט און 10 z-סעקשאַנז געמאַרקט מיט ERES. די נידעריקער פּאַנעל אין (B) און די פּאַנעל אין (C) ווייַזן פּראַסעסט בילדער צו ווייַזן בלויז די סחורות פאָרשטעלן אין ERES (מאַגענטאַ) [Gas1-GFP (גרוי) און Mid2-iRFP (ליכט בלוי)]. (C) עפֿענען פײַל: ERES טראָגט בלויז איין שטיק לאַסט (1 ביז 4). גרויער פײַל: ERES אנטהאלט אפגעזונדערטע לאסט (5). ווייסער פעסטער פײַל: ERES אנטהאלט קא-לאקירטן לאסט. אונטן: דער אויסגעקליבענער איינציקער ERES אנטהאלט נאר Gas1-GFP (1) אדער Mid2-iRFP (2). סקאַלע באַר, 100 נאַנאָמעטער. (D) קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון דעם פֿאָטאָמיקראָגראַף באַשריבן אין (C). דער דורכשניטלעכער פּראָצענט פֿון ERES וואָס אנטהאלט נאר איין לאסט (Gas1-GFP אדער Mid2-iRFP), אפגעזונדערטע לאסט און איבערלאַפּנדיקע לאסט. אין דריי אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן, n=432 אין 54 צעלן. טעות באַר = SD. צוויי-זײַטיקער אומגעפּאָרטער t טעסט. *** P = 0.0002. (E) 3D בילד פֿון אויסגעקליבענער ERES פֿון קוואַראַנטינירטן לאסט געמאַרקט מיט (C). Gas1-GFP (גרין) (3) אדער Mid2-iRFP (בלוי) (4) גייט אַרײַן אין ERES (מאַגענטאַ) פֿון איין זײַט און איז באַגרענעצט צו אַ קליין געגנט אין ERES. מאַנטשמאָל, גייען ביידע טיפּן לאסט אַרײַן אין דער זעלבער ERES (5) פֿון דער זעלבער זײַט און זענען באַגרענעצט צו אַן אפגעזונדערטן געגנט אין דער ERES. סקאַלע באַר, 100 נם.
ווייטער, האבן מיר געטעסט א היפאטעזע אז דער לאנגער אסיל קייט סעראַמיד (C26) וואס איז פאראן אין דער ER מעמבראן טרייבט די ספעציפישע קלאסטערינג און סארטירונג פון Gas1 אין סעלעקטיווער ERES. צו דעם צוועק, האבן מיר גענוצט א מאדיפיצירטער הייוון שטאם GhLag1, אין וועלכן די צוויי ענדאָגענע סעראַמיד סינטהאַזעס Lag1 און Lac1 זענען געווארן ערזעצט דורך GhLag1 (דער Lag1 האָמאָלאָג פון וואַטע), רעזולטירנדיק אין א הייוון שטאם מיט א צעל מעמבראן סעראַמיד שטאם קירצער ווי ווילד טיפּ (פיגור 3A) (28). מאַסע ספּעקטראָמעטריע (MS) אַנאַליז האט געוויזן אז אין ווילד-טיפּ שטאַמען, 95% פון די גאַנצע סעראַמיד איז זייער לאַנג (C26) קייט סעראַמיד, בשעת אין GhLag1, 85% פון די סעראַמיד איז זייער לאַנג (C18 און C16), נאָר 2% פון סעראַמיד איז זייער לאַנג (C26) קייט סעראַמיד. כאָטש C18 און C16 סעראַמידן זענען די הויפּט סעראַמידן וואָס זענען ביז איצט דעטעקטירט געוואָרן אין דער GhLag1 מעמבראַנע, האָט MS אַנאַליז אויך באַשטעטיקט אַז דער GPI אַנקער פון Gas1-GFP אויסגעדריקט אין דער GhLag1 שטאַם כּולל C26 סעראַמיד, וואָס איז פאַרגלייַכלעך צו ווילד-טיפּ ליפּידן. די קוואַליטעט איז די זעלבע (פיגור 3A) (26). דעריבער, דאָס מיינט אַז דער סעראַמיד רעמאָדעלינג ענזיים Cwh43 איז העכסט סעלעקטיוו פֿאַר C26 סעראַמיד, ווי געוויזן אין פיגור 26, עס פאַרבינדט פּרעפֿערענציעל דעם GPI אַנקער פון אַ קליינער סומע פון ​​C26 סעראַמיד אין דער GhLag1 שטאַם. S2 (29). דאָך, די צעל מעמבראַנע פון ​​GhLag1 כּולל באַזיקלי בלויז C18-C16 סעראַמיד, בשעת Gas1-GFP האט נאָך C26 סעראַמיד. דעם פאַקט מאכט דעם שטאַם אַן אידעאַל געצייַג צו ספּעציפֿיש סאָלווע די פּראָבלעם פון די אַסיל קייט לענג פון מעמבראַנע סעראַמיד אין די ER. די היפּאָטעטיש ראָלע פון ​​קלאַס און סאָרטינג. דערנאך, האבן מיר ערשט שטודירט די מעגלעכקייט פון C26 Gas1-GFP זיך צו אקומולירן אין קלאסטערס אין GhLag1 מיט א טעמפעראטור-סענסיטיווע מוטאנט אלעל פון sec31-1 דורך קאנווענציאנעלע פלוארעסענס מיקראסקאפיע, וואו נאר די לאנגע (C18-C16) קייט עקזיסטירט אין די ER מעמבראן סעראַמיד (פיגור 3). מיר האבן באמערקט אז אין sec31-1, איז רוב פון Gas1-GFP געווען קאנצענטרירט אין קלאסטערס, בשעת Gas1-GFP אין sec31-1 GhLag1 מיט לאנגע (C18-C16) לאנגע סעראַמיד ER מעמבראן איז געווען מערסטנס נישט קלאסטערד און פארשפרייט אין די גאנצע ER מעמבראן. צו זיין גענוי, ווייל C26 סעראַמיד-באזירטע קלאסטערינג איז ענג פארבונדן מיט ספעציפישע ERES (פיגור 1), האבן מיר דערנאך אויסגעפארשט צי דער פראצעס קען אויך ארייננעמען די פונקציע פון ​​די ER עקספארט פראטעין מעקאניזם. GPI-AP ניצט א ספעציעלע COPII סיסטעם פאר ER עקספארט, וואס איז אקטיוו רעגולירט דורך Ted1'ס סטרוקטורעלע רעמאדעלינג פון די גליקאן טייל פון די GPI אנקער (30, 31). דער רעקאָמבינאַנט GPI-גליקאַן ווערט דעמאָלט דערקענט דורך דעם טראַנסמעמבראַנע קאַרגאָ רעצעפּטאָר p24 קאָמפּלעקס, וואָס אין דער ריי סעלעקטיוו רעקרוטירט Lst1, וואָס איז אַ ספּעציפֿישער יסאָפאָרם פֿון דער הויפּט COPII קאַרגאָ בינדינג סוביוניט Sec24, שאַפֿנדיק אַ GPI-AP-רייַך COPII וועסיקלעס זענען נייטיק (31-33). דעריבער, האָבן מיר קאָנסטרויִרט אַ טאָפּל מוטאַנט וואָס האָט קאָמבינירט די דילעשאַן פֿון די איינציקע פּראָטעאינען (דער p24 קאָמפּלעקס קאָמפּאָנענט Emp24, GPI-גליקאַן רעמאָדעלינג ענזיים Ted1 און דער ספּעציפֿישער COPII סוביוניט Lst1) מיט דעם sec31-1 מוטאַנט שטאַם, און האָבן זיי שטודירט צי עס איז מעגלעך צו שאַפֿן Gas1-קלאַסטער GFP (פֿיגור 3). מיר האָבן באמערקט אַז אין sec31-1emp24Δ און sec31-1ted1Δ, איז Gas1-GFP הויפּטזעכלעך אַנקלאַסטערד און פֿאַרשפּרייט איבער דער ER מעמבראַנע, ווי פֿריִער געזען אין sec31-1 GhLag1, בשעת אין sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP ווי sec31-1. די רעזולטאַטן ווײַזן אָן אַז אין דערצו צו דער אנוועזנהייט פון C26 סעראַמיד אין דער ER מעמבראַנע, דאַרף די קלאַסטערינג פון Gas1-GFP אויך בינדן זיך צום p24 קאָמפּלעקס, און דאַרף נישט קיין ספּעציפֿישע Lst1 רעקרוטמענט. דערנאָך, האָבן מיר אויסגעפאָרשט די מעגלעכקייט אַז די קייט לענג פון סעראַמיד אין דער ER מעמבראַנע קען רעגולירן די בינדונג פון Gas1-GFP צו p24. אָבער, מיר האָבן געפֿונען אַז די אנוועזנהייט פון C18-C16 סעראַמיד אין דער מעמבראַנע אַפֿעקטירט נישט די GPI-גליקאַנען רעקאָנסטרויִרט דורך דעם p24 קאָמפּלעקס (פֿיגורן S3 און S4, A און B) אָדער בינדונג צו GPI-AP און עקספּאָרטינג GPI-AP. מעגלעכקייט. רעקרוט COPII סובטיפּ Lst1 (פֿיגור S4C). דעריבער, C26 סעראַמיד-אָפּהענגיקע קלאַסטערינג דאַרף נישט קיין פּראָטעין ינטעראַקשאַנז מיט פֿאַרשידענע ER עקספּאָרט פּראָטעין מעקאַניזמען, אָבער שטיצט אַן אַלטערנאַטיוון סאָרטינג מעקאַניזם געטריבן דורך ליפּיד לענג. דערנאָך, האָבן מיר אַנאַליזירט צי די סעראַמיד אַסיל קייט לענג אין דער ER מעמבראַנע איז וויכטיק פֿאַר דער עפֿעקטיווער קלאַסיפֿיקאַציע פון ​​Gas1-GFP ווי סעלעקטיוו ERES. זינט Gas1 אין דעם GhLag1 שטאַם מיט קורץ-קייט סעראַמיד פֿאַרלאָזט דעם ER און גייט אַרײַן אין דער פּלאַזמע מעמבראַנע (פֿיגור S5), גלויבן מיר אַז אויב די סאָרטירונג ווערט געטריבן דורך דער לענג פֿון דער סעראַמיד אַציל קייט, קען דער Gas1 אין דעם GhLag1 שטאַם ווערן רידערעקטעד און דורכגעקראָסט. ERES סחורות מיט דער זעלבער מעמבראַנע.
(א) די צעל מעמבראַנע פון ​​GhLag1 אנטהאלט בעיקר קירצערע C18-C16 סעראַמידן, בשעת דער GPI אַנקער פון Gas1-GFP האט נאך אלץ די זעלבע C26 IPC ווי ווילד-טיפּ צעלן. אויבן: אַסיל קייט לענג אנאליז פון סעראַמיד אין דער צעל מעמבראַנע פון ​​ווילד-טיפּ (Wt) און GhLag1p שטאַמען דורך מאַסע ספּעקטראָמעטריע (MS). די דאַטן רעפּרעזענטירן דעם פּראָצענט פון גאַנץ סעראַמיד. דער דורכשניט פון דריי אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. טעות באַר = SD. צוויי-זייַטיק אומגעפּאָרט t טעסט. **** P <0.0001. אונטערשטע פּאַנעל: MS אנאליז פון דער אַסיל קייט לענג פון די IPC פאָרשטעלן אין די Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI אַנקער אויסגעדריקט אין די ווילד-טיפּ און GhLag1p שטאַמען. די דאַטן רעפּרעזענטירן דעם פּראָצענט פון גאַנץ IPC סיגנאַל. דורכשניט פון פינף אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. טעות באַר = SD. צוויי-זייַטיק אומגעפּאָרט t טעסט. ns, נישט וויכטיק. P = 0.9134. (ב) פלואָרעסענס מיקראָגראַפס פון sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ און sec31-1lst1Δ צעלן וואָס אויסדריקן גאַלאַקטאָז-ינדוסט Gas1-GFP זענען אינקובירט געוואָרן ביי 37°C פֿאַר 30 מינוט און אריבערגעגעבן צו דורכפירן רוטין פלואָרעסענס מיקראָסקאָפּיע נאָך 24°C. ווייסער פייַל: ER Gas1-GFP קלאַסטער. אָפענער פייַל: אַנקלאַסטערד Gas1-GFP איז פאַרשפּרייט אויף דער גאַנצער ER מעמבראַנע, ווייַזנדיק די ER כאַראַקטעריסטישע נוקלעאַרע רינג פֿאַרבונג. סקאַלע באַר, 5μm. (C) קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​​​די פאָטאָמיקראָגראַף באַשריבן אין (ב). דער דורכשניטלעך פּראָצענט פון צעלן מיט פּונקטאַט Gas1-GFP סטרוקטור. אין דרייַ אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן, n≥300 צעלן. טעות באַר = SD. צוויי-זייַטיק אַנפּערד t טעסט. **** P <0.0001.
כדי גלייך צו לייזן דעם פראבלעם, האבן מיר דורכגעפירט א SCLIM וויזואליזאציע פון ​​Gas1-GFP און Mid2-iRFP אין GhLag1 מיטן sec31-1 טעמפעראטור-סענסיטיווע מוטאנט אלעל (פיגור 4 און פילם S4). נאכדעם וואס דער ER איז געהאלטן געווארן ביי 37°C און דערנאך באפרייט ביי 24°C, איז רוב פון דעם ניי סינטעזירטן Gas1-GFP נישט געווען קלאסטערד און פארשפרייט איבער דער גאנצער ER מעמבראן, ווי באמערקט דורך קאנווענציאנעלע מיקראסקאפן (פיגור 4, A און B). דערצו, א גרויסער פראצענט פון ERES (67%) שליסט איין צוויי טיפן לאסט וואס געפינען זיך צוזאמען אין אים (פיגור 4D). פאנעלן 1 און 2 פון פיגור 4C ווייזן צוויי טיפישע ביישפילן פון ERES מיט איבערלאפנדיקע Gas1-GFP און Mid2-GFP. דערצו, זענען ביידע סחורות רעקרוטירט געווארן אין דעם זעלבן ERES (פיגור 4E, פאנעל 3 און פילם S4). דעריבער, ווייזן אונזערע רעזולטאטן אז די לענג פון דער סעראַמיד אַציל קייט אין דער ER מעמבראן איז א וויכטיגער דעטערמינאנט פון ER פּראָטעין אַגרעגאַציע און קלאַסיפֿיקאַציע.
Sec31-1 GhLag1 צעלן וואָס אויסדריקן גאַלאַקטאָז-אינדוצירטע סעקרעציעס, Gas1-GFP (GPI-AP, גרין) און Mid2-iRFP (TMP, בלוי) און קאָנסטיטוטיוו ERES-מאַרקירט Sec13-mCherry (ERES, מאַגענטאַ). אינקובירן ביי 37°C. פאָרזעצן פֿאַר 30 מינוט, פאַלן צו 24°C צו באַפרייען סעקרעציעס, און בילד מיט SCLIM נאָך 20 מינוט. (A ביז C) רעפּרעזענטאַטיווע 2D פּראָיעקציע בילדער (A; וואָג באַר, 1μm) אָדער 3D צעל האַלבקוגל בילדער (B און C; וואָג אַפּאַראַט, 0.45μm) פון די 10 z-סעקציעס מאַרקירט דורך לאַסט און ERES. די נידעריקער פּאַנעל אין (B) און די פּאַנעל אין (C) ווייַזן פּראַסעסט בילדער צו ווייַזן בלויז די סכוירע פאָרשטעלן אין ERES (מאַגענטאַ) [Gas1-GFP (גרוי) און Mid2-iRFP (ליכט בלוי)]. (C) ווייס אָנגעפילט פייַל: ERES, סכוירע אָוווערלאַפּ. אפענער פײַל: ERES אנטהאלט נאר איין זאך. אונטערשטער טייל: די אויסגעקליבענע ERES האט איבערלאַפּנדיקע סחורות (1 און 2) געצייכנט אין (C). סקאַלע באַר, 100 נאַנאָמעטער. (D) קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון דער פֿאָטאָמיקראָגראַף באַשריבן אין (C). אין די sec31-1 און sec31-1 GhLag1 איינהייטן, איז נאר איין לאַסט (Gas1-GFP אדער Mid2-iRFP) אַרייַנגערעכנט, און דער דורכשניטלעכער פּראָצענט פֿון ERES פֿאַר אפגעזונדערטער לאַסט און איבערלאַפּנדיקער לאַסט. אין דריי אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן, n = 432 אין 54 צעלן (sec31-1) און n = 430 אין 47 צעלן (sec31-1 GhLag1). טעות באַר = SD. צוויי-זײַטיקער אומגעפּאָרטער t טעסט. *** P = 0.0002 (sec31-1) און ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D בילד פֿון אויסגעקליבענער ERES מיט איבערלאַפּנדיקער לאַסט (3) געצייכנט אין (C). Gas1-GFP (גרין) און Mid2-iRFP (בלוי) קומען צו צו ERES (מאַגענטאַ) פֿון דער זעלבער זײַט און בלײַבן אין דער זעלבער ERES באַגרענעצטער געגנט. סקאַלע באַר, 100 נאַנאָמעטער.
די שטודיע גיט דירעקטע אין וויוואָ באווייזן אז ליפּיד-באזירטע פּראָטעין לאַסטעס ווערן קלאַסיפיצירט אין סעלעקטיווע עקספּאָרט זייטלעך אין דעם סעקרעטאָרישן וועג, און אַנטפּלעקט די וויכטיקייט פון אַסיל קייט לענג פֿאַר קלאַסיפֿיקאַציע סעלעקטיוויטי. ניצנדיק אַ שטאַרקע און שניידנדיקע מיקראָסקאָפּי טעכניק גערופן SCLIM, האָבן מיר דעמאָנסטרירט דעם ניי סינטעזירטן Gas1-GFP (אַ הויפּט פּלאַזמע מעמבראַנע GPI-AP מיט אַ זייער לאַנגן אַסיל קייט (C26) סעראַמיד ליפּיד טייל) אין הייוון. די געגנטן קלאַסטערד אין דיסקרעטע ERs זענען פֿאַרבונדן מיט ספּעציפֿישע ERES, בשעת טראַנסמעמבראַנע סעקרעטירטע פּראָטעאינען זענען פאַרשפּרייט איבער דער ER מעמבראַנע (פיגור 1). אין דערצו, די צוויי טייפּס פון סחורות אַרייַן פאַרשידענע ERES סעלעקטיוולי (פיגור 2). די אַסיל קייט לענג פון די צעלולאַרע סעראַמיד אין דער מעמבראַנע איז רידוסט פון C26 צו C18-C16, די Gas1-GFP קלאַסטער איז דיסראַפּטיד אין די דיסקרעטע ER געגנט, און Gas1-GFP איז ריראָוטעד צו לאָזן די ER מיט די טראַנסמעמבראַנע פּראָטעין דורך די זעלבע ERES (פיגור 3 און פיגור 3). 4).
כאָטש GPI-AP ניצט אַ ספּעציאַליזירטן פּראָטעין מעханіזם צו אַרויסגיין פֿון ER, האָבן מיר געפֿונען אַז C26 סעראַמיד-אָפּהענגיקע צעשיידונג פֿאַרלאָזט זיך נישט אויף דיפֿערענציעלע פּראָטעין אינטעראַקציעס וואָס קענען פֿירן צו ERES ספּעציאַליזאַציע (פֿיגורן S4 און S5). אַנשטאָט, אונדזערע רעזולטאַטן שטיצן אַן אַלטערנאַטיוון קלאַסיפֿיקאַציע מעханіזם געטריבן דורך ליפּיד-באַזירט פּראָטעין קלאַסטערינג און דערנאָך אויסשליסונג פֿון אַנדערע לאַסט. אונדזערע אָבסערוואַציעס ווײַזן אַז די Gas1-GFP געגנט אָדער קלאַסטער פֿאַרבונדן מיט אַ ספּעציפֿישן ERES פֿעלט דעם טראַנסמעמבראַנע סעקרעטירטן פּראָטעין Mid2-iRFP, וואָס ווײַזט אַז די C26 סעראַמיד-אָפּהענגיקע GPI-AP קלאַסטער וועט פֿאַרלייכטערן זייער אַרײַנטרעטן אין די באַטרעפֿנדיקע ERES, און אין דער זעלבער צײַט, אויסשליסן טראַנסמעמבראַנע. די סעקרעציעס גייען אַרײַן אין דעם באַזונדערן ERES (פֿיגורן 1 און 2). אין קאַנטראַסט, די בייַזײַן פֿון C18-C16 סעראַמידן אין דער ER מעמבראַנע פֿאַראורזאַכט נישט אַז GPI-AP זאָל פֿאָרמירן געגנטן אָדער קלאַסטערס, אַזוי זיי אויסשליסן אָדער פֿאַרבײַטן נישט טראַנסמעמבראַנע סעקרעטירט פּראָטעאינען אין דער זעלבער ERES (פֿיגורן 3 און 4). דעריבער, מיר פֿאָרשלאָגן אַז C26 סעראַמיד טרייבט צעשיידונג און קלאַסיפֿיקאַציע דורך פֿאַרלייכטערן די קלאַסטערינג פון פּראָטעאינען לינגקט צו ספּעציפֿיש ERES.
ווי אזוי צו דערגרייכן דעם C26 סעראַמיד-אָפּהענגיקן קלאַסטערינג אין אַ ספּעציפֿישן ER געגנט? די טענדענץ פון מעמבראַן סעראַמיד צו צעשיידן זיך לאַטעראַל קען פאַרשאַפן GPI-AP און C26 סעראַמיד צו פאָרמירן קליינע און אינסטאַנטאַנאַנטלי אָרדנטלעכע ליפּידן אין דער מער ירעגולער ליפּיד סביבה פון דער ER מעמבראַן וואָס כּולל קירצערע און אַנסאַטשערייטיד גליסעראָליפּידן. קוואַליטעט קלאַסטערס (17, 18). די קליינע צייטווייליגע קלאַסטערס קענען ווייטער ווערן פיוזד אין גרעסערע, מער סטאַבילע קלאַסטערס נאָך ביינדינג צו די p24 קאָמפּלעקס (34). קאָנסיסטענט מיט דעם, מיר האָבן געוויזן אַז C26 Gas1-GFP דאַרף ינטעראַקט מיט די p24 קאָמפּלעקס צו פאָרמירן גרעסערע קענטיק קלאַסטערס (פיגור 3). דער p24 קאָמפּלעקס איז אַ העטעראָזיגאָוס אָליגאָמער קאַמפּאָוזד פון פיר פאַרשידענע p24 טראַנסמעמבראַן פּראָטעינס אין הייוון (35), וואָס גיט מולטיוואַלענט ביינדינג, וואָס קען פירן צו קראָס-לינקינג פון קליינע GPI-AP קלאַסטערס, דערמיט דזשענערייטינג גרעסערע סטאַבילע קלאַסטער (34). די אינטעראקציע צווישן די פּראָטעין עקטאָדאָמעינס פון GPI-APs קען אויך ביישטייערן צו זייער אַגרעגאַציע, ווי געוויזן בעת ​​זייער גאָלדזשי טראַנספּאָרט אין מאַמעליאַן פּאָלאַריזירטע עפּיטעליאַל צעלן (36). אָבער, ווען C18-C16 סעראַמיד איז פאָרשטעלן אין די ER מעמבראַנע, ווען די p24 קאָמפּלעקס בינדט זיך צו Gas1-GFP, גרויסע באַזונדערע קלאַסטערס וועלן נישט געשאפן ווערן. דער אונטערלייגנדיקער מעכאַניזם קען אָפענגען אויף די ספּעציפֿישע פיזישע און כעמישע אייגנשאַפטן פון די לאַנג אַסיל קייט סעראַמיד. ביאָפֿיזיקאַלישע שטודיעס פון קינסטלעכע מעמבראַנעס ווייַזן אַז כאָטש ביידע לאַנג (C24) און קורץ (C18-C16) אַסיל קייט סעראַמידעס קענען פאַרשאַפן פאַזע צעשיידונג, בלויז לאַנג אַסיל קייט סעראַמידעס (C24) קענען העכערן הויך קרומונג און פילם בייגן צו ריפאָרמען די פילם. דורך קעגנצייַטיק רעפֿערענץ (17, 37, 38). עס איז געוויזן געוואָרן אַז די טראַנסמעמבראַנע העליקס פון TMED2, דער מענטשלעכער האָמאָלאָג פון Emp24, אינטעראַקטירט סעלעקטיוו מיט C18 סעראַמיד-באַזירט ספינגאָמיעלין אין די ציטאָפּלאַזמישע לאָבולעס (39). ניצנדיק מאָלעקולאַרע דינאַמיק (MD) סימיאַליישאַנז, האָבן מיר געפֿונען אַז ביידע C18 און C26 סעראַמידעס אַקיומיאַלירן זיך אַרום די ציטאָפּלאַזמישע לאָבולעס פון די Emp24 טראַנסמעמבראַנע העליקס, און זיי האָבן ענלעכע פּרעפֿערענצן (פיגור S6). עס איז ווערט צו באַמערקן אַז דאָס ינדיקייץ אַז די טראַנסמעמבראַנע העליקס פון Emp24 קען פֿירן צו אַסימעטרישער פֿאַרשפּרייטונג פון ליפּידס אין דער מעמבראַנע. דאָס איז אַ לעצטע רעזולטאַט באַזירט אויף מאַמעליאַן סעלז. ענלעכע MD סימיאַליישאַנז ווייַזן אויך די בייַזייַן פון עטער ליפּידס (40). דעריבער, מיר ספּעקולירן אַז C26 סעראַמיד אין די צוויי לאָבולעס פון ER26 איז לאָקאַל ענריטשט. ווען GPI-AP אין די לומינאַל לאָבולעס בינדט זיך גלייך צו מולטיוואַלענט p24 און די אַקומולאַציע פון ​​C26 סעראַמיד אַרום p24 אין די ציטאָפּלאַזמישע לאָבולעס, קען עס פּראָמאָטירן די באַגלייטנדיקע פּראָטעין אַגגרעגאַציע און מעמבראַן קרומונג ווערן דזשענערירט דורך די פינגער (41), וואָס פאַראורזאַכט GPI-AP צו צעשיידן זיך אין דיסקרעטע געגנטן לעבן ERES, וואָס אויך פאַוואָריזירט די העכסט קרומע געגנטן פון די ER מעמבראַן (42). פריערדיקע באַריכטן האָבן געשטיצט דעם פארגעלייגטן מעקאַניזם (43, 44). די מולטיוואַלענטע בינדונג פון אָליגאָלעקטינס, פּאַטאַדזשענס אָדער אַנטיבאָדיעס צו סעראַמיד-באַזירטע גליקאָספינגאָליפּידס (GSL) אויף די פּלאַזמע מעמבראַן טריגערט גרויסע GSL אַגגרעגאַציע, פֿאַרשטאַרקט פאַזע צעשיידונג און פאַראורזאַכט מעמבראַן דעפאָרמאַציע און אינטערנאַליזאַציע (44). איוואבוטשי עטק. (43) מען האט געפונען אז אין דער אנוועזנהייט פון לאנגע (C24) אבער נישט קורצע (C16) אסיל קייטן, האט דער מולטיוואלענטער ליגאנד געבונדן צו GSL לאקטאסילסעראמיד אינדוצירט די פארמאציע פון ​​גרויסע קלאסטערס און מעמבראן אינוואגינאציע, און די ציטאפלאזמע לין-פארמיטלד סיגנאל טראנסדוקציע אויף די בלעטלעך איז אינטערדיגיטירט דורך אסיל קייטן אין פארבינדענע נעוטראפילן.
אין זויגער-צעלן פּאָלאַריזירטע עפּיטעליאַל צעלן, קאָנטראָלירט די קאָנצענטראַציע פון ​​דעם אַנטי-גאָלדזשי נעץ (TGN) ביזן לעוועל פון דער אַפּיקאַלער פּלאַזמע מעמבראַנע די צעשיידונג און סאָרטירונג פון GPI-AP (10, 45). די אַגגרעגאַציע ווערט געטריבן דורך GPI-AP אָליגאָמעריזאַציע (36), אָבער עס קען אויך אָפענגען אויף דער סעראַמיד קייט לענג וואָס מיר געפֿינען אין הייוון. כאָטש זויגער-GPI-AP האט אַן עטער ליפּיד-באַזירטן אַנקער, און זיין כעמישע סטרוקטור איז זייער אַנדערש פון דעם זייער לאַנגן אַסיל קייט סעראַמיד, האָט אַ פרישע שטודיע געפונען אַז ביידע ליפּידן האָבן עוואָלוציאָנער ענלעכע פיזישע און כעמישע אייגנשאַפטן און פונקציע (40). דעריבער, קען דער עטער ליפּיד טייל אין זויגער-צעלן זיין ענלעך צום C26 סעראַמיד אין הייוון, און זיין ראָלע איז צו פֿאַרבינדן זיך מיטן לאַנג-קייט סעראַמיד אין דער מעמבראַנע צו העכערן GPI-AP אַגגרעגאַציע און סאָרטירונג. כאָטש די מעגלעכקייט דאַרף נאָך ווערן געטעסט גלייך, שטיצן פריערדיקע געפינסן אַז דער טראַנספּאָרט פון דעם לאַנגן אַסיל קייט סעראַמיד צום גאָלדזשי גוף ווערט נישט דורכגעפירט דורך ציטאָפּלאַזמישע טראַנספער פּראָטעאינען, נאָר אָפענגען אויף דער סינטעז פון GPI אַנקערס ווי הייוון. דעריבער, דער עוואָלוציאָנערער קאָנסערוואַטיווער מעханіזם שיינט צו זיין ביכולת צו סעלעקטיוו קאָ-טראַנספּאָרטירן זייער לאַנגע אַסיל קייט סעראַמיד און GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) אין דער זעלביקער טראַנספּאָרט וועסיקל.
אין הייוון און זויגער פּאָלאַריזירטע עפּיטעליאַל צעל סיסטעמען, GPI-AP אַגרעגאַציע און צעשיידונג פון אנדערע פּלאַזמע מעמבראַן פּראָטעאינען אַלע פּאַסירן איידער זיי דערגרייכן די צעל ייבערפלאַך. פּאַלאַדינאָ עט על. (48) האָבן געפֿונען אַז אויף די TGN פון זויגער פּאָלאַריזירטע עפּיטעליאַל צעלן, GPI-AP קלאַסטערינג איז ניט בלויז נייטיק פֿאַר די סעלעקטיוו קלאַסיפיקאַציע פון ​​GPI-APs צו די אַפּיקאַל פּלאַזמע מעמבראַן, אָבער אויך רעגיאַלייץ די קלאַסטערינג אָרגאַניזאַציע פון ​​GPI-APs און זייַן ביאָלאָגיש טעטיקייט. צעל ייבערפלאַך. אין הייוון, דעם לערנען געוויזן אַז די C26 סעראַמיד-אָפענגיק GPI-AP קלאַסטער אויף די ER קענען רעגולירן די קלאַסטער אָרגאַניזאַציע און פאַנגקשאַנאַל טעטיקייט פון GPI-AP אויף די פּלאַזמע מעמבראַן (24, 49). קאָנסיסטענט מיט דעם מאָדעל, GhLag1 צעלן זענען אַלערדזשיק צו GPI ינכיבאַטאָרס אָדער דרוגס וואָס ווירקן צעל וואַנט אָרנטלעכקייט (28), און די נויט פֿאַר פאַנגקשאַנאַל Gas1-GFP קלאַסטערס (49) פון די שפּיץ סעראַמיד פּראַדזשעקטאַד אין די פּאָרינג פון הייוון צעלן ינדיקייץ G מעגלעך פיזיאַלאַדזשיקאַל קאַנסאַקווענסאַז פון hLag1 צעלן. GPI-AP טעות. אבער, ווייטערדיגע טעסטינג צי די פונקציאנעלע ארגאניזאציע פון ​​דער צעל-איבערפלאך איז פראגראמירט געווארן פון די ER דורך א סארטירונג מעטאד באזירט אויף ליפיד לענג וועט זיין דער טעמע פון ​​אונזער צוקונפטיגע פארשונג.
די Saccharomyces cerevisiae שטאַמען גענוצט אין דעם אַרבעט זענען ליסטעד אין טאַבעלע S1. די MMY1583 און MMY1635 שטאַמען פון SCLIM פֿאַר לעבעדיק צעל בילדגעבונג זענען קאַנסטראַקטאַד אין דעם הינטערגרונט פון W303. די שטאַמען וואָס אויסדריקן Sec13-mCherry מיט אַ פלורעסענט פּראָטעין טאַג זענען קאַנסטראַקטאַד ניצן אַ פּאָלימעראַזע קייט רעאַקציע (PCR)-באזירט מעטאָד מיט pFA6a פּלאַזמיד ווי אַ טעמפּלאַט (23). דער שטאַם וואָס אויסדריקן Mid2-iRFP לייבאַלד מיט פלורעסענט פּראָטעין אונטער דער קאָנטראָל פון די GAL1 פּראָמאָטער איז קאַנסטראַקטאַד ווי גייט. PCR אַמפּליפיקאַציע פון ​​iRFP-KanMx סיקוואַנס פון pKTiRFP-KAN וועקטאָר (מתנה פון E. O'Shea, Addgene פּלאַזמיד נומער 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; פאָרשונג רעסורס אידענטיפיצירער (RRID): Addgene_64687) און ינסערטאַד אין די C-טערמינוס פון ענדאָגענאָוס Mid2. נאכדעם וואס די Mid2-iRFP גענאם סיקווענס איז געווארן אַמפּליפיצירט און קלאָנירט אין דעם GAL1 פּראָמאָטער, איז עס אינטעגרירט געוואָרן אין דעם Not I-Sac I פּלאַץ פון דעם אינטעגראַציע פּלאַזמיד pRS306. דער רעזולטאַט פּלאַזמיד pRGS7 איז לינעאַריזירט געוואָרן מיט Pst I צו אינטעגרירן אין דעם URA3 לאָקוס.
דאס Gas1-GFP פיוזשאן גען ווערט אויסגעדריקט אונטער דער קאנטראל פון דעם GAL1 פראמאָטער אין דעם סענטראָמער (CEN) פּלאַזמיד, וואָס איז קאָנסטרויִרט ווי פאָלגט. די Gas1-GFP סיקוואַנס איז געוואָרן אַמפּליפֿיצירט דורך PCR פֿון דעם pRS416-GAS1-GFP פּלאַזמיד (24) (געשאַנק פֿון L. Popolo) און קלאָנירט אין דעם Xma I–Xho I אָרט פֿון דעם CEN פּלאַזמיד pBEVY-GL LEU2 (געשאַנק פֿון C). מילער; Addgene פּלאַזמיד נומער 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). דער רעזולטאַט פּלאַזמיד איז גערופֿן געוואָרן pRGS6. דאס Axl2-GFP פיוזשאן גען ווערט אויך אויסגעדריקט אונטער דער קאנטראל פֿון דעם GAL1 פראמאָטער פֿון דעם pBEVY-GL LEU2 וועקטאָר, און זיין קאָנסטרוקציע איז ווי פאָלגט. די Axl2-GFP סיקוואַנס איז געוואָרן אַמפּליפֿיצירט פֿון pRS304-p2HSE-Axl2-GFP פּלאַזמיד (23) דורך PCR, און קלאָנירט אין דעם Bam HI-Pst I אָרט פֿון pBEVY-GL LEU2 וועקטאָר. דער רעזולטאַט פּלאַזמיד איז גערופֿן געוואָרן pRGS12. די סיקוואַנס פֿון די אָליגאָנוקלעאָטידן געניצט אין דעם לערנען איז ליסטעד אין טאַבעלע S2.
דער שטאַם איז געוואָרן סופּלעמענטירט מיט 0.2% אַדענין און 2% גלוקאָזע [YP-דעקסטראָז (YPD)], 2% ראַפינאָזע [YP-ראַפינאָזע] רייך הייוון עקסטראַקט פּראָטעין p (YP) מעדיום (1% הייוון עקסטראַקט און 2% פּראָטעין ept). (YPR)] אָדער 2% גאַלאַקטאָז [YP-גאַלאַקטאָז (YPG)] ווי אַ קאַרבאָן מקור, אָדער אין אַ סינטעטישן מינימאַלן מעדיום (0.15% הייוון שטיקשטאָף באַזע און 0.5% אַמאָוניום סולפֿאַט) צו סופּלעמענטירן די פּאַסיקע אַמינאָ זויערן און באַזעס וואָס זענען נויטיק פֿאַר דערנערונג, און וואָס האָט ענטהאַלטן 2% גלוקאָזע (סינטעטישער גלוקאָזע מינימאַלער מעדיום) אָדער 2% גאַלאַקטאָז (סינטעטישער גאַלאַקטאָז מינימאַלער מעדיום) ווי אַ קאַרבאָן מקור.
פֿאַר רעאַל-צייט בילדגעבונג, טעמפּעראַטור-סענסיטיווע sec31-1 מוטאַנט צעלן וואָס אויסדריקן דעם קאָנסטרוקט אונטער דעם GAL1 פּראָמאָטער זענען געוואַקסן אין YPR מעדיום ביי 24°C איבער נאַכט ביז מיטל-לאָג פאַזע. נאָך אינדוקציע אין YPG ביי 24°C פֿאַר 1 שעה, די צעלן זענען אינקובירט געוואָרן אין SG ביי 37°C פֿאַר 30 מינוט, און דערנאָך טראַנספערירט צו 24°C צו באַפרייען זיך פֿון דעם סעקרעציע בלאָק. קאָנקאַנאַוואַלין A איז געניצט געוואָרן צו פֿיקסירן די צעלן אויף אַ גלאָז שלייַף און בילדגעמאַכט דורך SCLIM. SCLIM איז א קאמבינאציע פון ​​אן Olympus IX-71 אינווערטירטן פלואָרעסענס מיקראסקאפ און UPlanSApo 100×1.4 נומערישע אפערטור אויל לענס (Olympus), הויך-גיכקייט און הויך-סיגנאל-צו-ראַש פאַרהעלטעניש ראָטייטינג דיסק קאָנפאָקאַל סקאַנער (Yokogawa Electric), מנהג ספּעקטראָמעטער, און מנהג קאָאָלינג. די סיסטעם'ס בילד אינטענסיפייער (Hamamatsu Photonics) קען צושטעלן א מאַגניפייינג לענס סיסטעם מיט א לעצט מאַגניפיקאַטיאָן פון ×266.7 און א טשאַרדזש-קאָפּלעד דעווייס קאַמעראַ וואָס טאפלט עלעקטראָנען (Hamamatsu Photonics) (21). בילד אַקוויזישאַן איז דורכגעפירט דורך מנהג ווייכווארג (Yokogawa Electric). פֿאַר 3D בילדער, מיר האָבן געניצט אַ מנהג-געמאכט פּיעזאָעלעקטריק אַקטואַטאָר צו וויברירן די אָביעקטיוו לענס ווערטיקאַל, און געזאמלט די אָפּטישע טיילן 100 נם באַזונדער אין אַ סטאַק. די Z-סטאַק בילד איז קאָנווערטעד אין 3D וואָקסעל דאַטן, און די טעאָרעטישע פונט פאַרשפּרייטן פונקציע געניצט פֿאַר די ראָטייטינג דיסק קאָנפאָקאַל מיקראסקאפ איז געניצט פֿאַר דעקאָנוואַלושאַן פּראַסעסינג דורך Volocity ווייכווארג (PerkinElmer). דורך ניצן וואָלאָסיטי ווייכווארג צו אויטאָמאַטיש באַשטימען די טרעשאָולד פֿאַר קאָלאָקאַציע אַנאַליז, איז ERES אַרייַנגערעכנט לאַסט געמאָסטן געוואָרן. ליניע סקען אַנאַליז איז דורכגעפירט געוואָרן מיט מעטאַמאָרף ווייכווארג (מאָלעקולאַר דעווייסעס).
ניצט GraphPad Prism ווייכווארג צו באַשטימען סטאַטיסטישע באַדייטונג. פֿאַר די צוויי-זייַטיקע סטודענט'ס ט-טעסט און די געוויינטלעכע איין-וועג אַנאַליז פון וועריאַנס (ANOVA) טעסט, ווערן די אונטערשיידן צווישן גרופּעס באַטראַכט ווי האָבן אַ באַדייטנדיקע השפּעה אויף P <0.05 (*).
פאר פלואָרעסענס מיקראָסקאָפּיע פון ​​Gas1-GFP, זענען די לאָג פאַזע צעלן געוואַקסן איבער נאַכט אין YPD און געזאַמלט דורך צענטריפוגאַציע, געוואַשן צוויי מאָל מיט פאָספֿאַט באַפֿערד סאַלין, און אינקובירט אויף אייז פֿאַר לפּחות 15 מינוט, און דערנאָך ווייטער געגאַנגען אונטערן מיקראָסקאָפּ ווי פריער באַשריבן טשעק (24). דער Leica DMi8 מיקראָסקאָפּ (HCX PL APO 1003/1.40 אויל PH3 CS) אויסגעשטאַט מיט אַן אָביעקטיוו לינז, L5 (GFP) פֿילטער, Hamamatsu קאַמעראַ און Application Suite X (LAS X) ווייכווארג איז געניצט געוואָרן פֿאַר אַקוויזיציע.
די מוסטערן זענען דענאטורירט געוואָרן מיט SDS מוסטער באַפער ביי 65°C פֿאַר 10 מינוט, און דערנאָך אפגעשיידט דורך SDS-פּאָליאַקרילאַמיד געל עלעקטראָפאָרעזיס (PAGE). פֿאַר יממונאָבלאָטטינג אַנאַליז, איז 10 μl פון מוסטער געלאָדן פּער ליין. ערשטיק אַנטיבאָדי: ניצט קיניגל פּאָליקלאָנאַל אַנטי-גאַס1 ביי אַ דיילושאַן פון 1:3000, קיניגל פּאָליקלאָנאַל אַנטי-עמפּ24 ביי אַ דיילושאַן פון 1:500, און קיניגל פּאָליקלאָנאַל אַנטי-GFP (אַ מתּנה פון ה. ריעזמאַן) ביי אַ דיילושאַן פון 1:3000. דער מויז מאָנאָקלאָנאַל אַנטי-Pgk1 אַנטיבאָדי איז געניצט געוואָרן ביי אַ דיילושאַן פון 1:5000 (אַ מתּנה פון דזש. דע לאַ קרוז). צווייטיק אַנטיבאָדי: כריין פּעראָקסידאַז (HRP) קאָנדזשוגירט ציג אַנטי-קיניגל יממונאָגלאָבולין G (IgG) געניצט ביי אַ דיילושאַן פון 1:3000 (פּירס). HRP-קאָנדזשוגירט ציג אַנטי-מויז IgG איז געניצט געוואָרן אין אַ דיילושאַן פון 1:3000 (פּירס). די ימיון רעאַקציע זאָנע איז באמערקט געוואָרן דורך די כעמילומינעסענס מעטאָד פון סופּערסיגנאַל וועסט פּיקאָ רעאַגענט (טהערמאָ פישער סייענטיפיק).
ווי באשריבן אין (31), איז דורכגעפירט געווארן א נאטירלעכע אימונאפּרעסיפּיטאציע עקספערימענט אויף דער בארייכערטער ER פראקציע. בקיצור, וואשט די הייוון צעלן מיט TNE באַפער [50 mM טריס-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM פענילמעטילסולפאניל פלואריד און פראטעאז אינהיביטאר געמיש) ביי 600 נם (OD600) ביי 100 אפטישע געדיכטקייט צוויי מאל. עס איז צעבראכן געווארן מיט גלאז קרעלן, און דערנאך זענען די צעל דעבריס און גלאז קרעלן אוועקגענומען געווארן דורך צענטריפוגאציע. דער סופערנאטאנט איז דערנאך צענטריפוגירט געווארן ביי 17,000 ג פאר 15 מינוט ביי 4°C. די פּעלעט איז ווידער אויפגעהענגט געווארן אין TNE און דידזשיטאַליס סאַפּאָנין איז צוגעגעבן געווארן צו א לעצטער קאנצענטראציע פון ​​1%. די סוספּענזיע איז אינקובירט געווארן פאר 1 שעה מיט ראָטאַציע ביי 4°C, און דערנאך זענען די נישט-אויפלעזלעכע קאמפאנענטן אוועקגענומען געווארן דורך צענטריפוגאציע ביי 13,000 ג ביי 4°C פאר 60 מינוט. פֿאַר Gas1-GFP אימונאָפּרעסיפּיטאַציע, ערשט פאַר-אינקובירן דעם מוסטער מיט ליידיקע אַגאַראָזע קרעלן (ChromoTek) ביי 4°C פֿאַר 1 שעה, און דערנאָך אינקובירן מיט GFP-Trap_A (ChromoTek) ביי 4°C פֿאַר 3 שעה. די אימונאָפּרעסיפּיטירטע קרעלן זענען געוואַשן געוואָרן פֿינף מאָל מיט TNE וואָס האָט ענטהאַלטן 0.2% דיגאָקסיגענין, עלוטירט מיט SDS מוסטער באַפֿער, אפגעזונדערט אויף SDS-PAGE, און אַנאַליזירט דורך אימונאָבלאָטטינג.
ווי באשריבן אין (31), איז דורכגעפירט געווארן קראָס-לינקינג באַשטימונג אויף דער ענריטשטער ER פראַקציע. בקיצור, די ענריטשטער ER פראַקציע איז אינקובירט געוואָרן מיט 0.5 mM דיטהיאָביס(סוקסינימידיל פּראָפּיאָנאַט) (פּירס, טערמאָ פישער סייענטיפיק, ראָקפֿאָרד, אילינאָי, USA; 20°C, 20 מינוט). די קראָסלינקינג רעאַקציע איז געשטערט געוואָרן דורך צולייגן גליצין (50 mM לעצט קאָנצענטראַציע, 5 מינוט, 20°C).
ווי פריער באשריבן (50), איז דורכגעפירט געווארן MS אנאליז פון סעראַמיד אין ווילד-טיפּ און GhLag1 שטאַמען. אין קורצן, צעלן זענען געוואקסן צו עקספּאָנענציעלער פאַזע (3 ביז 4 OD600 איינהייטן/מל) אין YPD ביי 30°C, און 25×107 צעלן זענען געזאמלט געווארן. זייער מעטאַבאָליזם איז געשטערט מיט טריכלאָראַסעטיק זויער. ניצט עקסטראַקציע סאָלווענט [עטאַנאָל, וואַסער, עטער, פּירידין און 4.2 N אַמאָוניום הידראָקסייד (15:15:5:1:0.018 v/v)] און 1.2 nmol פון אינערלעכן סטאַנדאַרט C17 סעראַמיד (860517, Avanti פּאָלאַר ליפּיד) קוואַליטעט). ניצט מאָנאָמעטהילאַמין רעאַגענט [מעטאַנאָל, וואַסער, n-בוטאַנאָל און מעטהילאַמין לייזונג (4:3:1:5 v/v)] צו דורכפירן מילדע אַלקאַלישע הידראָליז פון דעם עקסטראַקט, און דערנאָך ניצט וואַסער-געזעטיקטע n-בוטאַנאָל צו דעזאַלץ. צום סוף, איז דער עקסטראַקט ווידער אויפגעשוועבט געוואָרן אין אַ פּאָזיטיוון מאָדע סאָלווענט [כלאָראָפאָרם/מעטאַנאָל/וואַסער (2:7:1) + 5 mM אַמאָניום אַצעטאַט] און אינדזשעקטירט געוואָרן אין דעם מאַסע ספּעקטראָמעטער. מולטי-רעאַקציע מאָניטאָרינג (MRM) איז דורכגעפירט געוואָרן פֿאַר דער אידענטיפֿיקאַציע און קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון ספֿינגאָליפּיד מאָלעקולן. דער TSQ Vantage טערציערי קוואַדרופּאָל מאַסע ספּעקטראָמעטער (Thermo Fisher Scientific) איז אויסגעשטאַט מיט אַ ראָבאָטישן נאַנאָפֿלאָו יאָן מקור Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) פֿאַר ליפּיד אַנאַליז. די קאָליזיע ענערגיע איז אָפּטימיזירט פֿאַר יעדער סעראַמיד קאַטעגאָריע. MS דאַטן זענען באַקומען געוואָרן אין פּאָזיטיוון מאָדע. פֿאַר יעדער ביאָלאָגישער רעפּליקאַט, איז דער ליפּיד סיגנאַל דער מעדיאַן פֿון דריי אומאָפּהענגיקע מעסטונגען.
ווי באשריבן אין (31), די צעלן (800×107) וואָס אויסדריקן Gas1-GFP זענען אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו נאַטירלעכער אימונאָפּרעסיפּיטאַציע. די פּיוראַפייד Gas1-GFP איז אפגעשיידט געוואָרן דורך SDS-PAGE און טראַנספערד צו אַ פּאָליווינילידען פלאָריד (PVDF) מעמבראַנע. די פּראָטעין איז וויזואַליזירט געוואָרן דורך פֿאַרבן PVDF מיט אַמיד שוואַרץ. די Gas1-GFP באַנד איז געשניטן געוואָרן פֿון די PVDF און געוואַשן 5 מאָל מיט מעטאַנאָל און איין מאָל מיט פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע-MS (LC-MS) גראַד וואַסער. דורך אינקובירן די מעמבראַנע סטריפּ מיט 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), באַפֿער און 500μl פריש אויפֿגעלייזטע 1 M נאַטריום ניטריט געמיש ביי 37°C פֿאַר 3 שעה, ווערט די ליפּיד פֿראַקציע באַפֿרייט פֿון Gas1-GFP און געלייזט. באַפֿרייַונג פֿון אינאָסין פֿאָספֿאַט סעראַמיד צווישן גלוקאָסאַמין און אינאָסיטאָל (51). דערנאָך, איז די מעמבראַנע סטריפּ געוואַשן געוואָרן פֿיר מאָל מיט LC-MS גראַד וואַסער, געטריקנט ביי צימער טעמפּעראַטור, און געהאַלטן אין אַ שטיקשטאָף אַטמאָספֿערע ביי -80°C ביז אַנאַליז. אלס א קאנטראל, איז א ליידיגע מוסטער פון PVDF מעמבראן גענוצט געווארן פאר יעדן עקספערימענט. דער ליפּיד עקסטראקטירט פון Gas1-GFP איז דאן אנאליזירט געווארן דורך MS ווי באשריבן (50). אין קורצן, PVDF סטריפּס מיט GPI-ליפּיד זענען ווידער אויפגעהענגט געווארן אין 75μl נעגאטיוון פורעם סאָלווענט [כלאָראָפאָרם/מעטאַנאָל (1:2) + 5 mM אַמאָניום אַסעטאַט] און דורכגעגאנגען עלעקטראָספּריי יאָניזאַציע (ESI)-MRM/MS אנאליז פון ספינגאָליפּיד מינים (TSQ Vantage). אין דעם פאַל, איז MS דאַטן באקומען געווארן אין נעגאטיוון יאָן מאָדע.
ווי פריער דערמאנט, איז דער ליפּיד טייל פון דעם GPI אַנקער אפגעשיידט געוואָרן פון דעם [3H]-אינאָסיטאָל-באַצייכנטן GPI-AP (16). די ליפּידן זענען אפגעשיידט געוואָרן דורך דין-שיכט כראָמאַטאָגראַפֿיע ניצנדיק אַ סאָלווענט סיסטעם (55:45:10 כלאָראָפֿאָרם-מעטאַנאָל-0.25% KCl) און וויזואַליזירט ניצנדיק FLA-7000 (Fujifilm).
די צעלן וואָס אויסדריקן Gas1-GFP (600×107) זענען געוואַשן געוואָרן צוויי מאָל מיט TNE באַפער, און צעבראָכן מיט גלאָז קרעלן, און דערנאָך סענטריפוגירט צו באַזייַטיקן צעל דעבריס און גלאָז קרעלן. דער סופּערנאַטאַנט איז דערנאָך סענטריפוגירט געוואָרן ביי 17,000 ג פֿאַר 1 שעה ביי 4°C. די פּעלעט איז געוואַשן געוואָרן אין TNE און אינקובירט מיט 1 U PI-PLC (Invitrogen) אין TNE מיט 0.2% דידזשאַטאַליס סאַפּאָנין פֿאַר 1 שעה ביי 37°C. נאָך דער ענזיים באַהאַנדלונג, איז די מעמבראַנע אַוועקגענומען געוואָרן דורך סענטריפוגאַציע ביי 17,000 ג ביי 4°C פֿאַר 1 שעה. צו אימונאָפּרעסיפּיטירן Gas1-GFP, איז דער סופּערנאַטאַנט אינקובירט געוואָרן מיט GFP-Trap_A (ChromoTek) ביי 4°C איבער נאַכט. דער פּיוראַפייד Gas1-GFP אפגעשיידט דורך SDS-PAGE איז געפֿאַרבט געוואָרן מיט Coomassie בריליאַנט בלוי. די Gas1-GFP פֿאַרבונג באַנד איז אָפּגעשניטן געוואָרן פֿון דעם גרויען אַרום דעם אַקוועדוקט, און דערנאָך נאָך אַלקילאַציע מיט יאָדאָאַסעטאַמיד און רעדוקציע מיט דיטיאָטהרעיטאָל, איז דורכגעפֿירט געוואָרן אין-געל פֿאַרדייאונג מיט טריפּסין. עקסטראַקט און טריקנט טריפּטישע פּעפּטיידן און פּעפּטיידן מיט GPI-גליקאַנען. דער טרוקענער פּעפּטייד איז אויפֿגעלייזט געוואָרן אין 20 μl וואַסער. אינדזשעקטירט אַ טייל (8μl) אין דעם LC. אַן אָקטאַדעצילסילאַן (ODS) קאָלום (דעוועלאָסיל 300ODS-HG-5; אינעווייניקסטער דיאַמעטער 150 מם × 1.0 מם; נאָמוראַ כעמישער, אַיטשי פּרעפֿעקטור, יאַפּאַן) איז געניצט געוואָרן צו צעשיידן פּעפּטיידן אונטער ספּעציפֿישע גראַדיענט באַדינגונגען. די מאָבילע פֿאַזע איז סאָלווענט A (0.08% פֿאָרמיק זויער) און סאָלווענט B (0.15% פֿאָרמיק זויער אין 80% אַצעטאָניטריל). אן Accela HPLC סיסטעם (Thermo Fisher Scientific, באסטאן, מאסאטשוסעטס) איז גענוצט געווארן צו עלוטירן די קאלום מיט סאָלווענט A אינערהאלב 55 מינוט מיט א שטראָם ראטע פון ​​50 μl מינוט-1 פאר 5 מינוט, און דערנאך איז די קאנצענטראציע פון ​​סאָלווענט B געוואקסן צו 40%. , פאראייניגטע שטאטן). די עלואַט איז קאנטינעווערלי אריינגעפירט געווארן אין די ESI יאָן מקור, און די טריפּטיק פּעפּטיידז און פּעפּטיידז מיט GPI-גליקאַנס זענען אנאליזירט געווארן דורך LTQ Orbitrap XL (היבריד לינעאַר יאָן טראַפּ-אָרביטראַפּ מאַסע ספּעקטראָמעטער; Thermo Fisher Scientific). אין די MS סעטאַפּ, די וואָולטאַזש פון די קאַפּילאַר מקור איז געשטעלט געווארן צו 4.5 kV, און די טעמפּעראַטור פון די טראַנספער קאַפּילאַר איז געהאלטן געווארן ביי 300°C. די קאַפּילאַר וואָולטאַזש און רער לינז וואָולטאַזש זענען געשטעלט געווארן צו 15 V און 50 V, ריספּעקטיוולי. MS דאַטן איז באַקומען אין די positive ion מאָדע (רעזאָלוציע פון ​​60,000; מאַסע אַקיעראַסי פון 10 טיילן פּער מיליאָן) אין אַ מאַסע קייט פון 300/m/z מאַסע/לאָד פאַרהעלטעניש (m/z) 3000. די MS/MS דאַטן איז באַקומען דורך די יאָן טראַפּ אין די LTQ Orbitrap XL [די ערשטע 3 דידזשאַץ אויף וועלכע די דאַטן דעפּענדס, קאָליזיע ינדוסט דיסאָסיאַטיאָן (CID)].
MD סימולאציעס זענען דורכגעפירט געווארן מיט GROMACS (52) ווייכווארג און MARTINI 2 קראפט פעלד (53-55). דער CHARMM GUI מעמבראן בילדער (56, 57) איז דאן גענוצט געווארן צו קאנסטרואירן א ביילייער וואס אנטהאלט דיאלעאילפאספאטידילכאלין (DOPC) און Cer C18 אדער DOPC און Cer C26. די טאפאלאגיע און קאארדינאטן פון Cer C26 זענען אפגעצויגן פון DXCE דורך ארויסנעמען די עקסטערע קרעלן פון די ספינגאסין עק. ניצט דעם פראצעס באשריבן אונטן צו באלאנסירן די דאפעלטע שיכט און לויפט עס, דאן ניצט די לעצטע קאארדינאטן פון די סיסטעם צו בויען א סיסטעם וואס אנטהאלט Emp24. די טראנסמעמבראן דאמעין פון הייוון Emp24 (רעזידוען 173 ביז 193) איז קאנסטרואירט געווארן אלס אן α-העליקס מיט די וויזועלע MD (VMD) געצייג מאלעקולארע סטרוקטור (58). דאן, נאך ארויסנעמען די איבערלאפנדיקע ליפידן, איז די פראטעין גראב גראניולירט געווארן און אריינגעשטעלט אין די ביילייער מיט CHARMM GUI. די לעצטע סיסטעם אנטהאלט 1202 DOPC און 302 Cer C26 אדער 1197 DOPC און 295 Cer C18 און Emp24. יאניזירט די סיסטעם צו א קאנצענטראציע פון ​​0.150M. פיר אומאפהענגיקע רעפליקאטן זענען געמאכט געווארן פאר צוויי ביילייער קאמפאזיציעס.
די ליפּיד ביילייער ווערט באַלאַנסירט מיטן CHARMM GUI פּראָצעס, וואָס באַשטייט פון מינימיזירן און דערנאָך באַלאַנסירן 405,000 טריט, וואו די פּאָזיציע באַגרענעצונגען ווערן ביסלעכווייַז רעדוצירט און עלימינירט, און דער צייט טריט ווערט געוואקסן פון 0.005 פּס צו 0.02 פּס. נאָך גלייכגעוויכט, פּראָדוצירט עס 6 µs מיט אַ צייט טריט פון 0.02 פּס. נאָך אײַנשטעלן Emp24, ניצט דעם זעלבן CHARMM GUI פּראָצעס צו מינימיזירן און באַלאַנסירן דאָס סיסטעם, און דערנאָך לויפט עס פֿאַר 8 סעקונדעס אין פּראָדוקציע.
פֿאַר אַלע סיסטעמען, בעת דעם באַלאַנסירן פּראָצעס, ווערט דער דרוק קאָנטראָלירט דורך דעם בערענדסען באַראָסטאַט (59), און בעת ​​דעם פּראָדוקציע פּראָצעס, ווערט דער דרוק קאָנטראָלירט דורך דעם פּאַרינעלאָ-ראַהמאַן באַראָסטאַט (60). אין אַלע פֿאַלן, איז דער דורכשניטלעכער דרוק 1 באַר און מען ניצט אַ האַלב-איזאָטראָפּישע דרוק קאַפּלינג סכעמע. אין דעם באַלאַנס און פּראָדוקציע פּראָצעס, ווערט אַ טערמאָסטאַט (61) מיט גיכקייט ריקאַליבראַציע געניצט צו קאַפּלען די טעמפּעראַטור פֿון פּראָטעין, ליפּיד און סאָלווענט פּאַרטיקלען ריספּעקטיוולי. בעת דער גאַנצער אָפּעראַציע, איז די ציל טעמפּעראַטור 310K. די ניט-בונדינג ינטעראַקשאַן ווערט קאַלקולירט דורך דזשענערירן אַ פּאָרינג רשימה ניצן די ווערלעט סכעמע מיט 0.005 באַפֿער טאָלעראַנץ. דער קולאָמב טערמין ווערט קאַלקולירט ניצן דעם רעאַקציע פֿעלד און אַ קאַט-אָף דיסטאַנס פֿון 1.1 נם. דער וואַנדער וואַלס טערמין ניצט אַ קאַט-אָף סכעמע מיט אַ קאַט-אָף דיסטאַנס פֿון 1.1 נם, און די ווערלעט קאַט-אָף סכעמע ווערט געניצט פֿאַר פּאָטענציעל דריפֿט (62).
ניצנדיק VMD, איז די אפשניט-וועלענלענג צווישן DOPC פאספאט בעדס אדער סעראַמיד AM1 בעדס און דעם פּראָטעין 0.7 נאַנאָמעטער, און די צאָל ליפּידן וואָס אינטעראַקטירן מיטן פּראָטעין ווערט אויסגערעכנט. לויט דער פאלגענדער פאָרמולע, אויסרעכנט דעם דיפּלישאַן-ענריטשמענט (DE) פאַקטאָר ווי אין (63): DE פאַקטאָר = (די סומע פון ​​גאַנץ ליפּידן אין דעם פּראָטעין 0.7) אין דעם פּראָטעין 0.7 (די סומע פון ​​Cer אין גאַנץ ליפּידן)
דער באריכטעטער ווערט ווערט באקומען אלס א דורכשניט, און די טעות-שטענגלעך זענען פיר אומאפהענגיקע קאפיעס פון SE. די סטאטיסטישע באדייטונג פון DE פאקטאר ווערט אויסגערעכנט דורך א ט-טעסט [(דורכשניטלעךDE-פאקטאר-1)/SE]. אויסרעכענען דעם P-ווערט פון דער איין-זייַטיקער פארטיילונג.
דער GROMACS געצייַג איז גענוצט געוואָרן צו רעכענען די 2D לאַטעראַלע געדיכטקייט מאַפּע פון ​​דער סיסטעם וואָס כּולל Emp24 אין די לעצטע 250 ns פון דער שפּור. כּדי צו באַקומען די ענריטשמענט/דיפּלישאַן מאַפּע פון ​​סעראַמיד, ווערט די געדיכטקייט מאַפּע פון ​​Cer צעטיילט דורך דער סומע פון ​​דער מאַפּע פון ​​Cer און DOPC, און דערנאָך צעטיילט דורך דער קאָנצענטראַציע פון ​​Cer אין דעם גוף. די זעלבע קאָליר מאַפּע וואָג ווערט גענוצט.
פֿאַר נאָך מאַטעריאַלן פֿאַר דעם אַרטיקל, ביטע זען http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
דאָס איז אַן אָפֿן אַקסעס אַרטיקל פֿאַרשפּרייט אונטער די באַדינגונגען פֿון דער Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, וואָס ערלויבט די נוצן, פֿאַרשפּרייטונג און רעפּראָדוקציע אין יעדן מעדיום, ווי לאַנג ווי די לעצטע נוצן איז נישט פֿאַר קאמערציעלע געווינס און די פּרעמיס איז אַז די אָריגינעלע אַרבעט איז ריכטיק. רעפֿערענץ.
נאטיץ: מיר בעטן אייך נאר צו געבן אייער בליצפּאָסט אַדרעס, אַזוי אַז דער מענטש וואָס איר רעקאָמענדירט צו דער בלאַט זאָל וויסן אַז איר ווילט אַז זיי זאָלן זען דעם בליצפּאָסט און אַז עס איז נישט ספּאַם. מיר וועלן נישט כאַפּן קיין בליצפּאָסט אַדרעסן.
די פראגע ווערט גענוצט צו טעסטן צי איר זענט א באזוכער און צו פארמיידן אויטאמאטישע ספאם אריינשיקונג.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez-Lineopa (Ana Maria Sergio-Linero) (מיהאָ וואַגאַ), מיסאַקאָ אַרמאַן (מיסאַקאָ אַרמאַן), מיאַקאָ רימאַן (מיאַקאָ רימאַן), פּראָו אַקיראַ, סטעפאַנאָ פאַני, אַקיהיקאָ נאַקאַנאָ, מאַנועל מוניז
3D הויך-רעזאָלוציע רעאַל-צייט בילדגעבונג אַנטפּלעקט די וויכטיקייט פון סעראַמיד קייט לענג פֿאַר פּראָטעין סאָרטינג אין סעלעקטיוו אַוטפּוט זייטלעך.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez-Lineopa (Ana Maria Sergio-Linero) (מיהאָ וואַגאַ), מיסאַקאָ אַרמאַן (מיסאַקאָ אַרמאַן), מיאַקאָ רימאַן (מיאַקאָ רימאַן), פּראָו אַקיראַ, סטעפאַנאָ פאַני, אַקיהיקאָ נאַקאַנאָ, מאַנועל מוניז
3D הויך-רעזאָלוציע רעאַל-צייט בילדגעבונג אַנטפּלעקט די וויכטיקייט פון סעראַמיד קייט לענג פֿאַר פּראָטעין סאָרטינג אין סעלעקטיוו אַוטפּוט זייטלעך.
©2020 אמעריקאנער אַססאָסיאַטיאָן פֿאַר די אַדוואַנסמאַנט פון וויסנשאַפֿט. אַלע רעכט רעזערווירט. AAAS איז אַ שוטעף פון HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef און COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.