דער אַרטיקל איז טייל פֿון דער פֿאָרשונג טעמע "פֿאַרבעסערן די קעגנשטעל פֿון לעגיומז צו פּאַטאָגענס און פּעסץ", זען אַלע 5 אַרטיקלען
דער אורזאַך פון דער פונגוס פלאַנצן קראַנקייט נעקראָזיס סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום (ליב.) דע באַרי ניצט אַ פֿיל-שטאַפּל סטראַטעגיע צו אָנשטעקן פֿאַרשידענע באַלעבאָס פלאַנצן. די שטודיע פֿאָרשלאָגט די נוצן פון די דיאַמין ל-אָרניטין, אַ ניט-פּראָטעין אַמינאָ זויער וואָס סטימולירט די סינטעז פון אנדערע עסענטשאַל אַמינאָ זויערן, ווי אַן אַלטערנאַטיווע פאַרוואַלטונג סטראַטעגיע צו פֿאַרבעסערן די מאָלעקולאַר, פיזיאַלאַדזשיקאַל און בייאָוקעמיקאַל ריספּאָנסעס פון פאַסעאָלוס ווולגאַריס ל. צו ווייַס פורעם געפֿירט דורך פּסעוודאָמאָנאַס סקלעראָטיאָרום. אין וויטראָ עקספּערימענטן האָבן געוויזן אַז ל-אָרניטין באַדייטנד ינכיבאַטעד די מיסעליאַל וווּקס פון ס. פּירענאָידאָסאַ אין אַ דאָזע-אָפענגיק שטייגער. דערצו, עס קען באַדייטנד רעדוצירן די שטרענגקייַט פון ווייַס פורעם אונטער גרינכאַוס באדינגונגען. דערצו, ל-אָרניטין סטימולירט די וווּקס פון די באהאנדלט פלאַנצן, וואָס ינדיקייץ אַז די טעסטעד קאַנסאַנטריישאַנז פון ל-אָרניטין זענען נישט פיטאָטאָקסיק צו די באהאנדלט פלאַנצן. דערצו, האט L-ארניטין פארשטארקט די אויסדרוק פון נישט-ענזימאטישע אנטיאקסידאנטן (טאטאלע סאליובלע פענאליקן און פלאוואנאאידן) און ענזימאטישע אנטיאקסידאנטן (קאטאלאזע (CAT), פעראקסידאז (POX), און פאליפענאל אקסידאז (PPO)), און פארגרעסערט די אויסדרוק פון דריי אנטיאקסידאנט-פארבונדענע גענען (PvCAT1, PvSOD, און PvGR). ווייטער, אין סיליקא אנאליז האט געוויזן די אנוועזנהייט פון א מעגליכע אקסאלאצעטאט אצטילהידראלאז (SsOAH) פראטעין אין די S. sclerotiorum גענאם, וואס איז געווען זייער ענלעך צו די אקסאלאצעטאט אצטילהידראלאז (SsOAH) פראטעאינען פון Aspergillus fijiensis (AfOAH) און Penicillium sp. (PlOAH) אין טערמינען פון פונקציאנעלע אנאליז, קאנסערווירטע דאמעינען, און טאפאלאגיע. אינטערעסאנט, די צוגאב פון L-ארניטין צו קארטאפל דעקסטראז בראָט (PDB) מעדיום האט באדייטנד פארקלענערט די אויסדרוק פון SsOAH גען אין S. sclerotiorum מיסעליע. אזוי אויך, עקזאגענע אנווענדונג פון L-ארניטין האט באדייטנד פארקלענערט די אויסדרוק פון SsOAH גען אין פונגאַל מיסעליאַ געזאמלט פון באהאנדלטע פלאַנצן. צום סוף, L-ארניטין אנווענדונג האט באדייטנד פארקלענערט אקסאַליק זויער סעקרעציע אין ביידע PDB מעדיום און אינפעקטירטע בלעטער. אין מסקנא, L-ארניטין שפּילט אַ שליסל ראָלע אין אויפהאלטן דעם רעדאָקס סטאַטוס ווי אויך פֿאַרבעסערן די פאַרטיידיקונג ענטפער פון אינפעקטירטע פלאַנצן. די רעזולטאַטן פון דעם לערנען קען העלפֿן אין אַנטוויקלען ינאָוואַטיווע, ענווייראָנמענטאַלי פרייַנדלעך מעטהאָדס צו קאָנטראָלירן ווייַס פורעם און פאַרמינערן זייַן פּראַל אויף בין פּראָדוקציע און אנדערע געוויקסן.
ווייסע פורעם, געפֿירט דורך דעם נעקראָטראָפֿישן פונגוס סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום (ליב.) דע באַרי, איז אַ פֿאַרניכטנדיקע, פּראָדוקציע-רעדוצירנדיקע קראַנקייט וואָס שטעלט אַ ערנסטע סכּנה פֿאַר דער גלאָבאַלער פּראָדוקציע פֿון בינען (Phaseolus vulgaris L.) (באָלטאָן et al., 2006). סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום איז איינע פֿון די שווערסטע באָדן-געטראָגענע פונגוס פלאַנצן פּאַטאָגענס צו קאָנטראָלירן, מיט אַ ברייטער גאַסטגעבער קייט פֿון איבער 600 פלאַנצן מינים און די מעגלעכקייט צו שנעל מאַסערירן גאַסטגעבער געוועבן אין אַ ניט-ספּעציפֿישן שטייגער (ליאַנג און ראָללינס, 2018). אונטער אומגינציקע באַדינגונגען, גייט עס דורך אַ קריטישע פֿאַזע פֿון זיין לעבן ציקל, בלייבט שלאָפֿנדיק פֿאַר לאַנגע פּעריאָדן ווי שוואַרצע, שווערע, זוימען-ווי סטרוקטורן גערופֿן 'סקלעראָטיאַ' אין באָדן אָדער ווי ווייסע, פּוכיקע וואוקסן אין דעם מייסעליום אָדער שטאַם-מערב פֿון אינפֿיצירטע פלאַנצן (שוואַרץ et al., 2005). S. sclerotiorum איז טויגיק צו פארמירן סקלעראָטיאַ, וואָס ערלויבט עס צו איבערלעבן אין אינפעקטירטע פעלדער פאר לאַנגע צייטן און צו בלייבן בעת ​​קראַנקייט (Schwartz et al., 2005). סקלעראָטיאַ זענען רייך אין נוטריאַנץ, קענען בלייבן אין דער ערד פאר לאַנגע צייטן, און דינען ווי דער ערשטיקער אינאָקולום פאר שפּעטערדיקע אינפעקציעס (Schwartz et al., 2005). אונטער גינסטיגע באדינגונגען, סקלעראָטיאַ דזשערמאַנירן און פּראָדוצירן לופט-געטראָגענע ספּאָרן וואָס קענען אינפעקטירן אַלע אויבערערדיקע טיילן פון דער פלאַנץ, אַרייַנגערעכנט אָבער נישט לימיטעד צו בלומען, שטענגלעך אָדער פּאָדס (Schwartz et al., 2005).
סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום ניצט אַ פֿילשטאַפּיקע סטראַטעגיע צו אינפֿיצירן אירע באַלעבאָס־פֿלאַנצן, וואָס נעמט אַרײַן אַ סעריע קאָאָרדינירטע געשעענישן פֿון סקלעראָטישער קערנונג ביז סימפּטאָם־אַנטוויקלונג. אָנהייב, פּראָדוצירט S. סקלעראָטיאָרום סוספּענדירטע ספּאָרן (גערופֿן אַסקאָספּאָרן) פֿון שוואָם־ווי סטרוקטורן גערופֿן אַפּאָטעציע, וואָס ווערן לופֿטגעטראָגן און אַנטוויקלען זיך אין נישט־באַוועגלעכע סקלעראָטיע ​​אויף אינפֿיצירטע פלאַנצן־דעבריס (באָלטאָן עט אַל., 2006). דער שוואָם סעקרעטירט דאַן אָקסאַלישע זויער, אַ ווירולענץ־פֿאַקטאָר, צו קאָנטראָלירן די pH פֿון דער פלאַנצן־צעל־וואַנט, העלפֿן מיט ענזימאַטישער דעגראַדאַציע און געוועב־אינוואַזיע (העגעדוס און רימער, 2005), און אונטערדריקן דעם באַלעבאָס־פֿלאַנץ'ס אָקסידאַטיוון אויסברוך. דער פֿאַרזויערונגס־פּראָצעס שוואַכט די פלאַנצן־צעל־וואַנט, און גיט אַ גינסטיגע סבֿיבֿה פֿאַר דער נאָרמאַלער און עפֿעקטיווער אָפּעראַציע פֿון שוואָם־צעל־וואַנט־דעגראַדירנדיקע ענזימען (CWDEs), און דערמעגלעכט דעם פּאַטאָגען צו איבערקומען די פֿיזישע באַריערע און דורכדרינגען די באַלעבאָס־געוועבן (מאַרקיאַנאָ עט אַל., 1983). אַמאָל דורכגעדרונגען, סעקרעטירט S. sclerotiorum אַ צאָל CWDEs, ווי פּאָליגאַלאַקטוראָנאַזע און צעלולאַזע, וואָס ערמעגלעכן זיין פאַרשפּרייטונג אין ינפעקטירטע געוועבן און פאַראורזאַכן געוועב נעקראָזיס. די פּראָגרעס פון לעזשאַנז און היפאַל מאַטעס פירט צו די כאַראַקטעריסטישע סימפּטאָמס פון ווייסע פורעם (Hegedus און Rimmer, 2005). דערווייל, דערקענען באַלעבאָס פלאַנצן פּאַטאַדזשען-פֿאַרבונדענע מאָלעקולאַרע פּאַטערנז (PAMPs) דורך מוסטער דערקענונג רעצעפּטאָרן (PRRs), וואָס טריגערט אַ סעריע פון ​​סיגנאַלינג געשעענישן וואָס לעסאָף אַקטיווירן פאַרטיידיקונג רעספּאָנסעס.
טראָץ יאָרצענדליקער פון קראַנקייט קאָנטראָל השתדלות, בלייבן מאַנגלען פון גענוג קעגנשטעליק גערמפּלאַזם אין בינען, ווי אין אַנדערע קאמערציעלע פלאנצן, רעכט צו דער קעגנשטעל, איבערלעבונג און אַדאַפּטאַביליטי פון די פּאַטאַדזשען. קראַנקייט פאַרוואַלטונג איז דעריבער גאָר טשאַלאַנדזשינג און ריקווייערז אַן אינטעגרירטע, פֿילפֿאַסעטיק סטראַטעגיע וואָס כולל אַ קאָמבינאַציע פון ​​קולטורעלע פּראַקטיקעס, ביאָלאָגישע קאָנטראָל און כעמישע פאַנדזשאַסיידז (אָ'סאַליוואַן עט על., 2021). כעמישע קאָנטראָל פון ווייַס פורעם איז די מערסט עפעקטיוו ווייַל פאַנדזשאַסיידז, ווען געווענדט ריכטיק און אין דער ריכטיקער צייט, קענען עפעקטיוו קאָנטראָלירן די פאַרשפּרייטונג פון די קראַנקייט, רעדוצירן די שטרענגקייט פון ינפעקציע און מינאַמייז ייעלד פארלוסטן. אָבער, אָווועריוז און אָוווערריליאַנס אויף פאַנדזשאַסיידז קענען פירן צו דער אויפֿקום פון קעגנשטעליק סטריינז פון S. sclerotiorum און נעגאַטיוולי ווירקן ניט-ציל אָרגאַניזאַמז, באָדן געזונט און וואַסער קוואַליטעט (לע קאָינטע עט על., 2016; סערעסיני עט על., 2024). דעריבער, געפֿינען ענווייראָנמענטאַלי פרייַנדלעך אַלטערנאַטיוון איז געוואָרן אַ שפּיץ פּריאָריטעט.
פּאָליאַמינען (PAs), ווי פּוטרעסין, ספּערמידין, ספּערמין, און קאַדאַווערין, קענען דינען ווי פּראַמישאַנט אַלטערנאַטיוון קעגן באָדן-געבוירענע פלאַנצן פּאַטאַדזשענס, דערמיט גאָר אָדער טיילווייז רעדוצירן די נוצן פון געפערלעכע כעמישע פונגיסיידן (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). אין העכערע פלאַנצן, PAs זענען ינוואַלווד אין פילע פיזיאַלאַדזשיקאַל פּראַסעסאַז אַרייַנגערעכנט, אָבער נישט לימיטעד צו, צעל טיילונג, דיפערענציאַציע, און ענטפער צו אַביאָטיש און ביאָטיש סטרעסאַז (Killiny און Nehela, 2020). זיי קענען דינען ווי אַנטיאַקסאַדאַנץ, העלפֿן כאַפּן רעאַקטיווע זויערשטאָף מינים (ROS), אויפֿהאַלטן רעדאָקס האָמעאָסטאַסיס (Nehela און Killiny, 2023), אינדוצירן פֿאַרטיידיקונג-פֿאַרבונדענע גענעס (Romero et al., 2018), רעגולירן פֿאַרשידענע מעטאַבאַלישע פּאַטווייז (Nehela און Killiny, 2023), מאָדולירן ענדאָגענע פֿיטאָכאָרמאָנעס (Nehela און Killiny, 2019), אויפֿשטעלן סיסטעמישע קונה קעגנשטעל (SAR), און רעגולירן פלאַנצן-פּאַטאַדזשען ינטעראַקשאַנז (Nehela און Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). עס איז ווערט צו באַמערקן אַז די ספּעציפֿישע מעקאַניזמען און ראָלעס פון PAs אין פלאַנצן פֿאַרטיידיקונג ווערייִרן דיפּענדינג אויף פלאַנצן מינים, פּאַטאַדזשענס, און סביבה באדינגונגען. די מערסט שעפעדיק PA אין פלאַנצן איז ביאָסינטעזירט פֿון די עסענטשאַל פּאָליאַמין L-אָרניטין (Killiny און Nehela, 2020).
ל-אָרניטין שפּילט קייפל ראָלעס אין פלאַנצן וווּקס און אַנטוויקלונג. למשל, פריערדיקע שטודיעס האָבן געוויזן אַז אין רייַז (Oryza sativa), קען אָרניטין זיין פֿאַרבונדן מיט נייטראָגען ריסייקלינג (Liu et al., 2018), רייַז טראָגן, קוואַליטעט און אַראָמאַ (Lu et al., 2020), און וואַסער דרוק רעאַקציע (Yang et al., 2000). דערצו, עקסאָגענע אַפּלאַקיישאַן פון ל-אָרניטין האט באַדייטנד פֿאַרבעסערט טריקעניש טאָלעראַנץ אין צוקער ביץ (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) און פֿאַרלייכטערט זאַלץ דרוק אין ציבעלע (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu און Çavuşoǧlu, 2021) און קאַשו (Anacardium occidentale) פלאַנצן (da Rocha et al., 2012). די פּאָטענציעלע ראָלע פון ​​ל-אָרניטין אין אַביאָטיש דרוק פֿאַרטיידיקונג קען זיין רעכט צו זיין ינוואַלוומאַנט אין פּראָלין אַקיומיאַליישאַן אין באהאנדלט פלאַנצן. למשל, גענעס פֿאַרבונדן מיט פּראָלין מעטאַבאָליזם, ווי אָרניטין דעלטאַ אַמינאָטראַנספֿעראַזע (דעלטאַ-OAT) און פּראָלין דעהידראָגענאַזע (ProDH1 און ProDH2) גענעס, זענען פריער געמאָלדן געוואָרן צו זיין ינוואַלווד אין דער פֿאַרטיידיקונג פֿון Nicotiana benthamiana און Arabidopsis thaliana קעגן נישט-גאַסטגעבער Pseudomonas syringae שטאַמען (Senthil-Kumar און Mysore, 2012). פֿון דער אַנדערער זייט, איז פונגאַל אָרניטין דעקאַרבאָקסילאַזע (ODC) נויטיק פֿאַר פּאַטאָגענעם וואוקס (Singh et al., 2020). צילן ODC פֿון Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici דורך גאַסטגעבער-ינדוסט דזשין שטילשטאַנד (HIGS) האָט באַדייטנד פֿאַרשטאַרקט די קעגנשטעל פֿון טאָמאַטאָ פלאַנצן צו Fusarium wilt (Singh et al., 2020). אָבער, די פּאָטענציעלע ראָלע פֿון עקסאָגענאָוס אָרניטין אַפּליקאַציע קעגן ביאָטישע סטרעסן ווי פֿיטאָפּאַטאָגענס איז נישט גוט געלערנט געוואָרן. נאך וויכטיגער, די ווירקונגען פון אָרניטין אויף קראַנקהייט קעגנשטעל און די פֿאַרבונדענע ביאָכעמישע און פיזיאָלאָגישע דערשיינונגען בלייבן לאַרגעלי אומאויסגעפאָרשט.
פֿאַרשטיין די קאָמפּלעקסיטעט פֿון S. sclerotiorum אינפֿעקציע פֿון לעגיומס איז וויכטיק פֿאַר דער אַנטוויקלונג פֿון עפֿעקטיווע קאָנטראָל סטראַטעגיעס. אין דעם לערנען, האָבן מיר געצילט צו ידענטיפֿיצירן די פּאָטענציעלע ראָלע פֿון דעם דיאַמין L-אָרניטין ווי אַ שליסל פֿאַקטאָר אין פֿאַרבעסערן די פֿאַרטיידיקונג מעקאַניזמען און קעגנשטעל פֿון לעגיומס געוויקסן צו סקלעראָטיניאַ סקלעראָטירום אינפֿעקציע. מיר פֿאָרשטעלן די כייפּאַטאַסאַז אַז, אין דערצו צו פֿאַרבעסערן די פֿאַרטיידיקונג רעאַקציעס פֿון אינפֿיצירטע געוויקסן, שפּילט L-אָרניטין אויך אַ שליסל ראָלע אין אויפֿהאַלטן דעם רעדאָקס סטאַטוס. מיר פֿאָרשלאָגן אַז די פּאָטענציעלע ווירקונגען פֿון L-אָרניטין זענען פֿאַרבונדן מיט דער רעגולאַציע פֿון ענזימאַטישע און ניט-ענזימאַטישע אַנטיאַקסאַדאַנט פֿאַרטיידיקונג מעקאַניזמען און ינטערפֿערענץ מיט שוואָם פּאַטאַגעניסיטי/ווירולענס פֿאַקטאָרן און פֿאַרבונדענע פּראָטעאינען. די צווייפֿאַכיקע פֿונקציאָנאַליטעט פֿון L-אָרניטין מאַכט עס אַ פֿאַרשפּרעכנדיק קאַנדידאַט פֿאַר אַ סאַסטיינאַבאַל סטראַטעגיע צו פֿאַרמינדערן די השפּעה פֿון ווײַסן פורעם און פֿאַרבעסערן די קעגנשטעל פֿון געוויינטלעכע לעגיומס געוויקסן צו דעם שטאַרקן שוואָם פּאַטאַגען. די רעזולטאַטן פֿון דער איצטיקער לערנען קענען העלפֿן אין דער אַנטוויקלונג פֿון ינאָוואַטיווע, עקאָלאָגיש פֿרײַנדלעכע מעטאָדן צו קאָנטראָלירן ווײַסן פורעם און פֿאַרמינדערן זײַן השפּעה אויף לעגיומס פּראָדוקציע.
אין דעם שטודיע, איז א סענסיטיוו קאמערציעלע סארט פון געוויינטלעכער בין, גיזא 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), גענוצט געווארן אלס עקספערימענטאל מאטעריאל. געזונטע זוימען זענען פריינדליך צוגעשטעלט געווארן דורך די לעגיומע פארשונג דעפארטמענט, פעלד קראפס פארשונג אינסטיטוט (FCRI), אגריקולטורעל פארשונג צענטער (ARC), מצרים. פינף זוימען זענען געזייט געווארן אין פלאסטיק טאפלעך (אינעווייניקסטער דיאמעטער 35 ס"מ, טיפקייט 50 ס"מ) געפילט מיט S. sclerotiorum-אינפעקטירטער ערד אונטער גרינהויז באדינגונגען (25 ± 2 °C, רעלאטיווע הומידיטי 75 ± 1%, 8 שעה ליכט/16 שעה טונקל). 7-10 טעג נאך זאען (DPS), זענען די זוימען אויסגעדינט געווארן צו לאזן נאר צוויי זוימען מיט גלייכמעסיגן וואוקס און דריי פולשטענדיג אויסגעברייטערטע בלעטער אין יעדן טאפ. אלע טאפ פלאנצן זענען באוואסערט געווארן איין מאל יעדע צוויי וואכן און באפרוכט געווארן מאנאטליך מיטן רעקאמענדירטן ראטע פאר דער געגעבענער סארט.
כדי צו צוגרייטן א 500 מג/ל קאנצענטראציע פון ​​L-ארניטינעדיאמין (אויך באקאנט אלס (+)-(S)-2,5-דיאמינאפעטאנאיק זויער; סיגמא-אלדריך, דארמשטאט, דייטשלאנד), איז 50 מג ערשט אויפגעלייזט געווארן אין 100 מל פון סטערילע דיסטילירט וואסער. די סטאק לייזונג איז דערנאך פארדיןנט געווארן און גענוצט אין נאכפאלגנדע עקספערימענטן. בקיצור, זעקס סעריעס פון L-ארניטינע קאנצענטראציעס (12.5, 25, 50, 75, 100, און 125 מג/ל) זענען געטעסט געווארן אין וויטרא. דערצו, איז סטערילע דיסטילירט וואסער גענוצט געווארן אלס א נעגאטיוון קאנטראל (מאק) און קאמערציעלע פונגיציד "ריזאלעקס-טי" 50% נאַס-פאודער (טאקלאפאס-מעטיל 20% + טיראם 30%; KZ-קאפר על זייאט פּעסטיצידן און כעמיקאלן פירמע, קאפר על זייאט, גארביע גובערניע, מצרים) איז גענוצט געווארן אלס א פאזיטיווער קאנטראל. דער קאמערציעלער פונגיציד "ריזאָלעקס-טי" איז געטעסט געוואָרן אין וויטראָ ביי פינף קאָנצענטראַציעס (2, 4, 6, 8 און 10 מג/ל).
מוסטערן פון געוויינטלעכע בין שטענגלעך און פּאָדס וואָס ווייַזן טיפּיש סימפּטאָמס פון ווייַס פורעם (ינפעסטאַציע קורס: 10-30%) זענען געזאמלט פון קאמערציעלע פאַרמס. כאָטש רובֿ פון די ינפעקטאַד פלאַנצן מאַטעריאַלס זענען יידענטאַפייד דורך מינים/וואַריאַט (סאַסעפּטאַבאַל קאמערציעלע פאַרשיידנקייַט גיזאַ 3), אנדערע, ספּעציעל די באקומען פון היגע מאַרקפלעצער, זענען געווען פון אומבאַקאַנט מינים. די געזאמלט ינפעקטאַד מאַטעריאַלס זענען ערשטער ייבערפלאַך דיסינפעקטעד מיט 0.5% סאָדיום היפּאָטשלאָריט לייזונג פֿאַר 3 מינוט, דעמאָלט שווענקען עטלעכע מאָל מיט סטערילע דיסטילייטיד וואַסער און ווישן טרוקן מיט סטערילע פילטער פּאַפּיר צו באַזייַטיקן וידעפדיק וואַסער. די ינפעקטאַד אָרגאַנען זענען דעמאָלט שנייַדן אין קליין ברעקלעך פון די מיטל געוועב (צווישן געזונט און ינפעקטאַד געוועבן), קולטיוואַטעד אויף קאַרטאָפל דעקסטראָז אַגאַר (PDA) מעדיום און ינקובייטיד ביי 25 ± 2 °C מיט אַ 12 שעה ליכט / 12 שעה טונקל ציקל פֿאַר 5 טעג צו סטימולירן סקלעראָטיאַ פאָרמירונג. די מיסעליאַל שפּיץ אופֿן איז אויך געניצט צו רייניקן פונגאַל יסאָלאַטעס פון געמישט אָדער קאַנטאַמאַנייטאַד קולטורן. די פּיוראַפייד פונגאַל יסאָלאַטע איז ערשטער יידענטאַפייד באזירט אויף זייַן קולטורעל מאָרפאַלאַדזשיקאַל קעראַקטעריסטיקס און דעמאָלט באשטעטיקט צו זיין S. sclerotiorum באזירט אויף מיקראָסקאָפּיק פֿעיִקייטן. צום סוף, זענען אלע גערייניקטע איזאלאטן געטעסט געווארן אויף פּאַטאַגעניסיטי אויף דער סאַסעפּטאַבאַלער געוויינטלעכער בין קולטיוואַר גיזאַ 3 צו טרעפן קאָך'ס פּאָסטולאַטן.
דערצו, דער מערסט אינוואזיווער S. sclerotiorum איזאלאט (איזאלאט #3) איז ווייטער באשטעטיקט געווארן באזירט אויף אינערליכער טראַנסקריבירטער ספּייסער (ITS) סיקווענסינג ווי באשריבן דורך ווייס עט אל., 1990; באַטוראָ-סיעשניעווסקאַ עט אל., 2017. בקיצור, איזאלאטן זענען קולטיווירט געווארן אין קאַרטאָפל דעקסטראָז בראָט (PDB) און אינקובירט ביי 25 ± 2 °C פאר 5-7 טעג. פונגאַל מיצעליום איז דעמאָלט געזאמלט געווארן, געפילטערט דורך קעז-טוך, געוואשן צוויי מאָל מיט סטעריל וואַסער, און געטריקנט מיט סטעריל פילטער פּאַפּיר. גענאָמישע דנאַ איז איזאלירט געווארן ניצנדיק די Quick-DNA™ פונגאַל/באַקטעריעל מיניפּרעפּ קיט (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). די ITS rDNA ראיאן איז דאן געווארן פארגרעסערט מיטן ספעציפישן פריימער פאר ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ערווארטעטע גרייס: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). די גערייניקטע PCR פראדוקטן זענען אריינגעגעבן געווארן פאר סיקווענסינג (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). די ITS rDNA סיקווענסן זענען סיקווענסט געווארן ביידירעקשאנעל מיטן Sanger סיקווענסינג מעטאד. די צוזאמענגעשטעלטע קווערי סיקווענסן זענען דאן געווארן פארגליכן מיט די לעצטע דאטן אין GenBank און דעם National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) מיטן נוצן BLASTn ווייכווארג. די קווערי סיקווענס איז געווארן פארגליכן מיט 20 אנדערע S. sclerotiorum שטאמען/איזאלאטן באקומען פון די לעצטע דאטן אין NCBI GenBank (Supplementary Table S1) מיטן נוצן ClustalW אין דעם Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; ווערסיע 11) (Kumar et al., 2024). עוואָלוציאָנערע אַנאַליז איז דורכגעפירט געוואָרן ניצנדיק די מאַקסימום ליקעליהאָאָד מעטאָדע און דעם אַלגעמיינעם צייט-רעווערסיבל נוקלעאָטיד סאַבסטיטוציע מאָדעל (ניי און קומאַר, 2000). דער בוים מיט דער העכסטער לאָג-לייקעליהאָאָד ווערט געוויזן. דער ערשטיקער בוים פֿאַר דער היוריסטישער זוכן ווערט אויסגעקליבן דורך אויסקלייבן דעם בוים מיט דער העכערער לאָג-לייקעליהאָאָד צווישן דעם נײַבער-דזשױנינג (NJ) בוים (קומאַר עט אַל., 2024) און דעם מאַקסימום פּאַרסימאָני (MP) בוים. דער NJ בוים איז קאָנסטרויִרט געוואָרן ניצנדיק אַ פּאָרװײַז דיסטאַנס מאַטריץ קאַלקולירט ניצנדיק דעם אַלגעמיינעם צייט-רעווערסיבל מאָדעל (ניי און קומאַר, 2000).
די אַנטיבאַקטיריעלע טעטיקייט פון L-אָרניטין און דעם באַקטעריציד "Rizolex-T" איז באַשטימט געוואָרן אין וויטראָ דורך דער אַגאַר דיפוזיע מעטאָדע. מעטאָדע: נעמט די פּאַסיקע מאָס פון דער לאַגער לייזונג פון L-אָרניטין (500 מג/ל) און מישט עס גוט מיט 10 מל פון דעם PDA נוטריאַנט מעדיום צו צוגרייטן לייזונגען מיט לעצט קאָנצענטראַציעס פון 12.5, 25, 50, 75, 100 און 125 מג/ל, ריספּעקטיוולי. פינף קאָנצענטראַציעס פון דעם פונגיציד "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 און 10 מג/ל) און סטעריל דיסטילירט וואַסער זענען געניצט געוואָרן ווי אַ קאָנטראָל. נאָכדעם ווי דער מעדיום איז געוואָרן פעסט, איז אַ פריש צוגעגרייטער מיסעליאַלער פּלאָג פון סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום קולטור, 4 מם אין דיאַמעטער, איבערגעפירט געוואָרן אין צענטער פון דער פּעטרי שיסל און קאָלטיווירט ביי 25±2°C ביז דער מיסעליום האָט באַדעקט די גאַנצע קאָנטראָל פּעטרי שיסל, נאָכדעם וואָס דער פונגוס וואוקס איז רעקאָרדירט ​​געוואָרן. רעכנט אויס די פראצענט אינהיביציע פון ​​ראדיאלן וואוקס פון S. sclerotiorum ניצנדיק גלייכונג 1:
דער עקספּערימענט איז געוואָרן איבערגעחזרט צוויי מאָל, מיט זעקס ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן פֿאַר יעדער קאָנטראָל/עקספּערימענטאַלער גרופּע און פינף טאָפּן (צוויי פלאַנצן פּער טאָפּ) פֿאַר יעדער ביאָלאָגישער רעפּליקאַט. יעדער ביאָלאָגישער רעפּליקאַט איז געוואָרן אַנאַליזירט צוויי מאָל (צוויי טעכנישע רעפּליקאַטן) צו זיכער מאַכן די אַקיעראַסי, פאַרלעסלעכקייט און רעפּראָדוצירבאַרקייט פון די עקספּערימענטאַלע רעזולטאַטן. אין דערצו, פּראָביט רעגרעסיע אַנאַליז איז געניצט געוואָרן צו רעכענען די האַלב-מאַקסימאַלער אינהיביטאָרישע קאָנצענטראַציע (IC50) און IC99 (פּרענטיס, 1976).
כדי צו אפשאצן דעם פאטענציאל פון L-ארניטין אונטער גרינכאַוס באדינגונגען, זענען דורכגעפירט געווארן צוויי נאכאנאנדע טאָפּ עקספּערימענטן. בקיצור, טאָפּן זענען אָנגעפילט געוואָרן מיט סטעריליזירטער ליים-זאַמד ערד (3:1) און אינאקולירט מיט אַ פריש צוגעגרייטער קולטור פון S. sclerotiorum. ערשטנס, איז דער מערסט ינווייסיוו איזאָלאַט פון S. sclerotiorum (איזאָלאַט #3) קאָלטיווירט געוואָרן דורך שניידן איין סקלעראָטיום אין האַלב, לייגן עס מיטן פּנים אַראָפּ אויף אַ PDA און אינקובירן ביי 25°C אין קאָנסטאַנטער פינצטערניש (24 שעה) פֿאַר 4 טעג צו סטימולירן מיסעליאַל וווּקס. פיר 5 מם דיאַמעטער אַגאַר פּלאַגז זענען דעמאָלט גענומען געוואָרן פון די פאָדערשטע ברעג און אינאקולירט מיט 100 ג פון אַ סטערילע געמיש פון ווייץ און רייז קלייען (1:1, v/v) און אַלע פלאַשן זענען אינקובירט געוואָרן ביי 25 ± 2 °C אונטער אַ 12 שעה ליכט/12 שעה פינצטערניש ציקל פֿאַר 5 טעג צו סטימולירן סקלעראָטיאַ פאָרמירונג. דער אינהאַלט פון אַלע פלאַשן איז גוט געמישט געוואָרן צו ענשור כאָומאָגענעיטי איידער צוגעבן ערד. דערנאך, איז 100 גראַם פון דער קאָלאָניזירנדיקער קלייען געמיש צוגעגעבן געוואָרן צו יעדן טאָפּ צו זיכער מאַכן אַ קאָנסטאַנטע קאָנצענטראַציע פון ​​פּאַטאָגענס. די אינאָקולירטע טאָפּן זענען באַוואַסערט געוואָרן צו אַקטיוויזירן פונגאַל וווּקס און געשטעלט געוואָרן אין גרינכאַוס באדינגונגען פֿאַר 7 טעג.
פינף זוימען פון דער גיזא 3 סארט זענען דאן געזייט געווארן אין יעדן טאפ. פאר די טאפלעך באהאנדלט מיט L-ארניטין און דעם פונגיציד ריזאלעקס-טי, זענען די סטעריליזירטע זוימען ערשט איינגעווייקט געווארן פאר צוויי שעה אין א וואסעריגער לייזונג פון די צוויי פארבינדונגען מיט א לעצטער IC99 קאנצענטראציע פון ​​בערך 250 מג/ל און 50 מג/ל, בהתאמה, און דאן לופט-געטריקנט פאר איין שעה פארן זייען. פון דער אנדערער זייט, זענען די זוימען איינגעווייקט געווארן אין סטעריל דיסטילירט וואסער אלס א נעגאטיוון קאנטראל. נאך 10 טעג, פארן ערשטן באוואסערן, זענען די זוימען אויסגעדינט געווארן, לאזנדיג נאר צוויי ריינע זוימען אין יעדן טאפ. דערצו, צו זיכער מאכן אינפעקציע מיט S. sclerotiorum, זענען בין פלאנץ שטענגלעך אין דער זעלבער אנטוויקלונג שטאפל (10 טעג) געשניטן געווארן אין צוויי פארשידענע לאקאציעס מיט א סטעריליזירטן סקאלפעל און בערך 0.5 ג פון דער קאלאניזירנדיקער קלייען געמיש איז אריינגעלייגט געווארן אין יעדער וואונד, נאכגעפאלגט דורך הויכע הומידיטי צו סטימולירן אינפעקציע און קראנקהייט אנטוויקלונג אין אלע אינאקולירטע פלאנצן. קאָנטראָל פלאַנצן זענען ענלעך פאַרוואונדעט געוואָרן און אַ גלייכע מאָס (0.5 ג) פון אַ סטערילער, נישט-קאָלאָניזירטער קלייען-מישונג איז געלייגט געוואָרן אין דער וואונד און געהאַלטן אונטער הויכער הומידיטי צו סימולירן די סביבה פֿאַר קראַנקהייט-אַנטוויקלונג און זיכער מאַכן קאָנסיסטענסי צווישן באַהאַנדלונג-גרופּעס.
באַהאַנדלונג מעטאָדע: בין זוימען זענען באַוואַסערט געוואָרן מיט 500 מל פון אַ וואַסעריקער לייזונג פון L-אָרניטין (250 מג/ל) אָדער דעם פונגיציד Rizolex-T (50 מג/ל) דורך באַוואַסערן דעם באָדן, דערנאָך איז די באַהאַנדלונג ווידערהאָלט געוואָרן דריי מאָל אין אַן אינטערוואַל פון 10 טעג. די פּלאַסעבאָ-באַהאַנדלטע קאָנטראָלן זענען באַוואַסערט געוואָרן מיט 500 מל פון סטעריל דיסטילירט וואַסער. אַלע באַהאַנדלונגען זענען דורכגעפירט געוואָרן אונטער גרינכאַוס באדינגונגען (25 ± 2°C, 75 ± 1% רעלאַטיווע הומידיטי, און אַ פאָטאָפּעריאָד פון 8 שעה ליכט/16 שעה פינצטערניש). אַלע טאָפּן זענען באַוואַסערט געוואָרן יעדע צוויי וואָכן און באַהאַנדלט מאָנטלעך מיט אַ באַלאַנסירטן NPK פערטילייזער (20-20-20, מיט 3.6% שוועבל און TE מיקראָעלעמענטן; Zain Seeds, מצרים) אין אַ קאָנצענטראַציע פון ​​3-4 ג/ל דורך בלאַט שפּריצן לויט די רעקאָמענדאַציעס פֿאַר די ספּעציפֿישע סאָרט און די אינסטרוקציעס פון די פאַבריקאַנט. אויב נישט אַנדערש געזאָגט, זענען גאָר אויסגעברייטערטע דערוואַקסענע בלעטער (2טע און 3טע בלעטער פון אויבן) געזאַמלט געוואָרן פון יעדן ביאָלאָגישן רעפּליקאַט 72 שעה נאָך באַהאַנדלונג (hpt), כאָומאַדזשענייזד, פּולד און סטאָרד ביי -80 °C פֿאַר ווייטערדיקע אַנאַליזעס אַרייַנגערעכנט, אָבער נישט לימיטעד צו, אין סיטו היסטאָטשעמישע לאָקאַליזאַציע פון ​​אָקסידאַטיוו דרוק אינדיקאַטאָרן, ליפּיד פּעראָקסידאַציע, ענזימאַטישע און ניט-ענזימאַטישע אַנטיאַקסאַדאַנץ און גען עקספּרעסיע.
ווייסע פורעם אינפעקציע אינטענסיטעט איז געווארן אפגעשאצט וועכנטליך 21 טעג נאך אינאקולאציע (dpi) ניצנדיג א סקאלע פון ​​1-9 (צוגאב טאבעלע S2) באזירט אויף דער פעטזאלדט און דיקסאן סקאלע (1996) מאדיפיצירט דורך טעראן עט אל. (2006). בקיצור, די שטענגלעך און צווייגן פון בין פלאנצן זענען געווארן אויסגעפארשט אנפאנגענדיג ביים פונקט פון אינאקולאציע צו נאכפאלגן די פארשריט פון לעזיעס צוזאמען אינטערנאדן און נאָודז. די דיסטאנץ פון די לעזיע פון ​​דעם פונקט פון אינאקולאציע ביזן ווייטסטן פונקט צוזאמען דעם סטעם אדער צווייג איז דאן געמאסטן געווארן און א כעזשבן פון 1-9 איז געווארן באשטימט באזירט אויף דער לאקאציע פון ​​די לעזיע, וואו (1) האט אנגעצייכנט קיין זיכטבארע אינפעקציע נאנט צום פונקט פון אינאקולאציע און (2-9) האט אנגעצייכנט א גראדועלער פארגרעסערונג אין לעזיע גרייס און פארשריט צוזאמען נאָודז/אינטערנאדן (צוגאב טאבעלע S2). ווייסע פורעם אינפעקציע אינטענסיטעט איז דאן געווארן קאנווערטירט צו פראצענט ניצנדיג פארמולע 2:
דערצו, די שטח אונטער דער קראנקהייט פּראָגרעס קורווע (AUDPC) איז געווען קאַלקיאַלייטיד ניצן די פאָרמולע (שאַנער און פיני, 1977), וואָס איז לעצטנס אַדאַפּטירט פֿאַר ווייסע פויל פון פּראָסט בינז (טשאַוהאַן עט על., 2020) ניצן גלייכונג 3:
וואו Yi = קראַנקייט שטרענגקייט אין צייט ti, Yi+1 = קראַנקייט שטרענגקייט אין ווייַטער צייט ti+1, ti = צייט פון ערשטער מעסטונג (אין טעג), ti+1 = צייט פון ווייַטער מעסטונג (אין טעג), n = גאַנץ נומער פון צייט פונקטן אָדער אָבסערוואַציע פונקטן. בין פלאַנצן וווּקס פּאַראַמעטערס אַרייַנגערעכנט פלאַנצן הייך (cm), נומער פון צווייגן פּער פלאַנץ, און נומער פון בלעטער פּער פלאַנץ זענען רעקאָרדעד וועכנטלעך פֿאַר 21 טעג אין אַלע ביאָלאָגישע רעפּליקאַץ.
אין יעדן ביאלאגישן רעפליקאט, זענען בלעטער מוסטערן (צווייטע און דריטע פולשטענדיג אנטוויקלטע בלעטער פון אויבן) געזאמלט געווארן אויף טאג 45 נאך באהאנדלונג (15 טעג נאך דער לעצטער באהאנדלונג). יעדע ביאלאגישע רעפליקאט האט באשטאנען פון פינף טאפלעך (צוויי פלאנצן פער טאפ). ארום 500 מג פון די צעקוועטשטע געוועב איז גענוצט געווארן פאר דער עקסטראקציע פון ​​פאטאסינטעטישע פיגמענטן (כלאָראָפיל a, כלאָראָפיל b און קאַראָטענאָידן) ניצנדיק 80% אַצעטאָן ביי 4 °C אין דער פינצטערניש. נאך 24 שעה, זענען די מוסטערן סענטריפוגירט געווארן און דער סופּערנאַטאַנט איז געזאמלט געווארן פאר דער באשטימונג פון כלאָראָפיל a, כלאָראָפיל b און קאַראָטענאָיד אינהאַלט קאָלאָרימעטריש ניצנדיק א UV-160A ספּעקטראָפאָטאָמעטער (Shimadzu Corporation, יאַפּאַן) לויט דער מעטאָדע פון ​​(Lichtenthaler, 1987) דורך מעסטן די אַבזאָרבאַנס ביי דריי פאַרשידענע כוואַליע לענגקטס (A470, A646 און A663 נם). צום סוף, איז דער אינהאַלט פון פאטאסינטעטישע פיגמענטן אויסגערעכנט געווארן ניצנדיק די פאלגנדע פאָרמולעס 4–6 באַשריבן דורך Lichtenthaler (1987).
72 שעה נאך דער באהאנדלונג (hpt), זענען בלעטער (צווייטע און דריטע פולשטענדיג אנטוויקלטע בלעטער פון אויבן) געזאמלט געווארן פון יעדן ביאלאגישן רעפליקאט פאר אין סיטו היסטאכעמישע לאקאליזאציע פון ​​וואסערשטאף פעראקסייד (H2O2) און סופעראקסייד אניאן (O2•−). יעדע ביאלאגישע רעפליקאט האט באשטאנען פון פינף טאפלעך (צוויי פלאנצן פער טאפ). יעדע ביאלאגישע רעפליקאט איז אנאליזירט געווארן אין דופליקאט (צוויי טעכנישע רעפליקאטן) צו פארזיכערן די גענויקייט, פארלעסלעכקייט און רעפראדוסירבארקייט פון דער מעטאד. H2O2 און O2•− זענען באשטימט געווארן מיט 0.1% 3,3′-דיאמינאבענזידין (DAB; Sigma-Aldrich, דארמשטאט, דייטשלאנד) אדער ניטראבלו טעטראזאליום (NBT; Sigma-Aldrich, דארמשטאט, דייטשלאנד), בהתאמה, נאכפאלגנדיג די מעטאדן באשריבן דורך ראמערא-פוערטאס עט אל. (2004) און אדאם עט אל. (1989) מיט קליינע מאדיפיקאציעס. פֿאַר היסטאָכעמישער לאָקאַליזאַציע פֿון H2O2 אין סיטו, זענען די בלעטלעך וואַקוום אינפֿילטרירט געוואָרן מיט 0.1% DAB אין 10 mM טריס באַפֿער (pH 7.8) און דערנאָך אינקובירט ביי צימער טעמפּעראַטור אין ליכט פֿאַר 60 מינוט. די בלעטלעך זענען אויסגעבלייטשט געוואָרן אין 0.15% (v/v) TCA אין 4:1 (v/v) עטאַנאָל:כלאָראָפֿאָרם (אַל-גאָמהאָריאַ פֿאַרמאַסוטיקאַלז און מעדיקאַל סאַפּלייז, קאַיראָ, מצרים) און דערנאָך אויסגעשטעלט צו ליכט ביז זיי זענען פֿאַרדונקלט געוואָרן. ענלעך, זענען די ווענטילן וואַקוום אינפֿילטרירט געוואָרן מיט 10 mM פּאָטאַסיום פֿאָספֿאַט באַפֿער (pH 7.8) וואָס ענטהאַלט 0.1 w/v % HBT פֿאַר היסטאָכעמישער לאָקאַליזאַציע פֿון O2•− אין סיטו. די בלעטלעך זענען אינקובירט געוואָרן אין ליכט ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 20 מינוט, דערנאָך אויסגעבלייטשט ווי אויבן, און דערנאָך באַלויכטן ביז טונקל בלויע/וויאָלעט פֿלעקן זענען דערשינען. די אינטענסיטעט פון די רעזולטירנדיקע ברוינע (אלס א H2O2 אינדיקאטאר) אדער בלוי-וויאלעט (אלס אן O2•− אינדיקאטאר) קאליר איז געווארן אפגעשאצט ניצנדיק די פידזשי ווערסיע פון ​​די בילד פראסעסינג פעקל ImageJ (http://fiji.sc; צוגעגריפן 7טן מערץ 2024).
מאַלאָנדיאַלדעכייד (MDA; ווי אַ מאַרקער פון ליפּיד פּעראַקסאַדיישאַן) איז באַשטימט געוואָרן לויט דער מעטאָדע פון ​​דו און בראַמלאַגע (1992) מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס. בלעטער פון יעדן ביאָלאָגישן רעפּליקאַט (צווייטע און דריטע גאָר אַנטוויקלטע בלעטער פון אויבן) זענען געזאַמלט געוואָרן 72 שעה נאָך דער באַהאַנדלונג (hpt). יעדער ביאָלאָגישער רעפּליקאַט האָט אַרייַנגענומען פינף טאָפּן (צוויי פלאַנצן פּער טאָפּ). יעדער ביאָלאָגישער רעפּליקאַט איז אַנאַליזירט געוואָרן אין דופּליקאַט (צוויי טעכנישע רעפּליקאַטן) צו ענשור די אַקיעראַסי, פאַרלאָזלעכקייט און רעפּראָדוסיביליטי פון דער מעטאָדע. בקיצור, 0.5 ג פון געמאָלן בלאַט געוועב איז געניצט געוואָרן פֿאַר MDA עקסטראַקציע מיט 20% טריכלאָראַסעטיק זויער (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) וואָס ענטהאַלט 0.01% בוטילאַטעד הידראָקסיטאָלוען (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). דער MDA אינהאַלט אין דעם סופּערנאַטאַנט איז דעמאָלט באַשטימט קאָלאָרימעטריש דורך מעסטן די אַבזאָרבאַנס ביי 532 און 600 נם מיט אַ UV-160A ספּעקטראָפאָטאָמעטער (Shimadzu Corporation, יאַפּאַן) און דעמאָלט אויסגעדריקט ווי nmol g−1 FW.
כדי צו באַשטימען נישט-ענזימאַטישע און ענזימאַטישע אַנטיאַקסאַדאַנטן, זענען בלעטער (צווייטע און דריטע גאָר אַנטוויקלטע בלעטער פֿון דער אויבערשטער טייל) געזאַמלט געוואָרן פֿון יעדן ביאָלאָגישן רעפּליקאַט 72 שעה נאָך דער באַהאַנדלונג (hpt). יעדע ביאָלאָגישע רעפּליקאַט האָט באַשטאַנען פֿון פֿינף טאָפּן (צוויי געוויקסן פּער טאָפּ). יעדע ביאָלאָגישע מוסטער איז אַנאַליזירט געוואָרן אין דופּליקאַט (צוויי טעכנישע מוסטערן). צוויי בלעטער זענען צעמאָלן געוואָרן מיט פֿליסיקן שטיקשטאָף און גענוצט גלייך פֿאַר באַשטימונג פֿון ענזימאַטישע און נישט-ענזימאַטישע אַנטיאַקסאַדאַנטן, גאַנץ אַמינאָ זויערן, פּראָלין אינהאַלט, גענע אויסדרוק, און אָקסאַלאַט קוואַנטיפֿיקאַציע.
גאַנץ סאַליאַבאַל פענאָליק איז באַשטימט געוואָרן מיט Folin-Ciocalteu רעאַגענט (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס פון דער מעטאָדע באַשריבן דורך Kahkonen et al. (1999). בקיצור, אַפּראָקסימאַטלי 0.1 ג פון כאָומאַדזשאַנייזד בלאַט געוועב איז עקסטראַקטעד מיט 20 מל 80% מעטאַנאָל אין דער פינצטערניש פֿאַר 24 שעה און די סופּערנאַטאַנט איז געזאמלט נאָך סענטריפוגאַציע. 0.1 מל פון די מוסטער עקסטראַקט איז געמישט מיט 0.5 מל Folin-Ciocalteu רעאַגענט (10%), געשאָקלט פֿאַר 30 סעקונדעס און געלאָזט אין דער פינצטערניש פֿאַר 5 מינוט. דערנאָך 0.5 מל פון 20% סאָדיום קאַרבאָנאַט לייזונג (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) איז צוגעגעבן צו יעדער טוב, געמישט גוט און אינקובירט ביי צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטערניש פֿאַר 1 שעה. נאָך אינקובאַציע, די אַבסאָרבאַנס פון די רעאַקציע געמיש איז געמאסטן ביי 765 נם מיט אַ UV-160A ספּעקטראָפאָטאָמעטער (Shimadzu Corporation, יאַפּאַן). די קאָנצענטראַציע פון ​​גאַנץ סאַליאַבאַל פענאָלס אין די מוסטער עקסטראַקטן איז געווען באַשטימט ניצן אַ גאַליק זויער קאַליבראַציע קורווע (פישער סייאַנטיפיק, העמפּטאָן, NH, USA) און אויסגעדריקט ווי מיליגראַם פון גאַליק זויער עקוויוואַלענט פּער גראַם פון פריש וואָג (מג GAE ג-1 פריש וואָג).
גאַנץ סאַליאַבאַל פלאַוואָנאָיד אינהאַלט איז באַשטימט געוואָרן לויט דער מעטאָדע פון ​​דזשערידאַנע עט אַל. (2006) מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס. בקיצור, 0.3 מל פון דעם אויבן דערמאנטן מעטאַנאָל עקסטראַקט איז געמישט געוואָרן מיט 0.3 מל פון 5% אַלומינום קלאָריד לייזונג (AlCl3; פישער סייענטיפיק, העמפּטאָן, NH, USA), שטאַרק גערודערט און דערנאָך אינקובירט ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 5 מינוט, און דערנאָך צוגעגעבן 0.3 מל פון 10% פּאָטאַסיום אַסעטאַט לייזונג (אַל-גאָמהאָריאַ פאַרמאַסוטיקאַלס און מעדיקאַל סאַפּלייז, קאַיראָ, מצרים), גוט געמישט און אינקובירט ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט אין דער פינצטערניש. נאָך אינקובאַציע, איז די אַבזאָרבאַנס פון דער רעאַקציע געמיש געמאָסטן געוואָרן ביי 430 נם מיט אַ UV-160A ספּעקטראָפאָטאָמעטער (שימאַדזו קאָרפּאָראַציע, יאַפּאַן). די קאָנצענטראַציע פון ​​גאַנץ סאַליאַבאַל פלאַוואָנאָידן אין מוסטער עקסטראַקטן איז באַשטימט געוואָרן מיט אַ רוטין קאַליבראַציע קורווע (TCI אַמעריקע, פּאָרטלאַנד, OR, USA) און דערנאָך אויסגעדריקט ווי מיליגראַם פון רוטין עקוויוואַלענט פּער גראַם פון פריש וואָג (מג RE g-1 פריש וואָג).
דער גאַנצער פרייער אַמינאָ זויער אינהאַלט פון בין בלעטער איז באַשטימט געוואָרן מיט אַ מאָדיפיצירטן נינהידרין רעאַגענט (טהערמאָ סייענטיפיק כעמיקאַלז, וואָלטהאַם, מאַ, USA) באַזירט אויף דער מעטאָדע פארגעשלאָגן דורך יאָקאָיאַמאַ און היראַמאַצו (2003) און מאָדיפיצירט דורך סאַן עט על. (2006). בקיצור, 0.1 ג פון געמאָלן געוועב איז עקסטראַקטירט געוואָרן מיט pH 5.4 באַפער, און 200 μL פון דעם סופּערנאַטאַנט איז רעאַגירט געוואָרן מיט 200 μL פון נינהידרין (2%) און 200 μL פון פּירידין (10%; ספּעקטרום כעמיקאַל, ניו בראַנזוויק, ניו דזשערזי, USA), אינקובירט אין אַ קאָכנדיק וואַסער וואַנע פֿאַר 30 מינוט, דערנאָך אָפּגעקילט און געמאָסטן ביי 580 נם מיט אַ UV-160A ספּעקטראָפאָטאָמעטער (שימאַדזו קאָרפּאָראַציע, יאַפּאַן). אויף דער אַנדערער זייט, פּראָלין איז באַשטימט געוואָרן דורך דער בייטס מעטאָדע (בייטס עט על., 1973). פּראָלין איז עקסטראַקטירט געוואָרן מיט 3% סולפאָסאַליסיל זויער (טהערמאָ סייענטיפיק כעמיקאַלז, וואָלטהאַם, מאַ, USA) און נאָך צענטריפוגאַציע, איז 0.5 מל פון דעם סופּערנאַטאַנט געמישט געוואָרן מיט 1 מל גלעטשער עסיק זויער (פישער סייענטיפיק, העמפּטאָן, NH, USA) און נינהידרין רעאַגענט, אינקובירט ביי 90°C פֿאַר 45 מינוט, אָפּגעקילט און געמאָסטן ביי 520 נם מיטן זעלבן ספּעקטראָפאָטאָמעטער ווי אויבן. גאַנץ פרייע אַמינאָ זויערן און פּראָלין אין די בלעטער עקסטראַקטן זענען באַשטימט געוואָרן מיט גליצין און פּראָלין קאַליבראַציע קורוועס (סיגמאַ-אַלדריטש, סט. לואיס, מאָ, USA), ריספּעקטיוולי, און אויסגעדריקט ווי מג/ג פרישע וואָג.
כדי צו באַשטימען די ענזימאַטישע אַקטיוויטעט פון אַנטיאַקסאַדאַנט ענזימען, איז אַפּראָקסימאַטלי 500 מג פון כאָומאַדזשענייזד געוועב עקסטראַקטעד מיט 3 מל פון 50 mM טריס באַפער (pH 7.8) מיט 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, סעינט לואיס, מאָ, USA) און 7.5% פּאָליווינילפּיראָלידאָן (PVP; Sigma-Aldrich, סעינט לואיס, מאָ, USA), סענטריפוגירט ביי 10,000 × g פֿאַר 20 מינוט אונטער קילקייט (4 °C), און דער סופּערנאַטאַנט (רויער ענזיים עקסטראַקט) איז געזאַמלט געוואָרן (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). קאַטאַלאַזע (CAT) איז דעמאָלט רעאַגירט געוואָרן מיט 2 מל פון 0.1 M נאַטריום פאָספֿאַט באַפֿער (pH 6.5; סיגמאַ-אַלדריטש, סעינט לואיס, מאָ, USA) און 100 μl פון 269 mM H2O2 לייזונג צו באַשטימען איר ענזימאַטישע אַקטיוויטעט לויט דער מעטאָדע פון ​​אַעבי (1984) מיט קליינע מאָדיפֿיקאַציעס (על-נאַגאַר עט אַל., 2023; אָסמאַן עט אַל., 2023). גוואַיאַקאָל-אָפּהענגיקע פּעראָקסידאַזע ​​(POX) ענזימאַטישע אַקטיוויטעט איז באַשטימט געוואָרן מיט דער מעטאָדע פון ​​האַראַטש עט אַל. (2009). (2008) מיט קליינע מאדיפיקאציעס (על-נאגאר עט אל., 2023; אסמאן עט אל., 2023) און די ענזימאטישע טעטיקייט פון פאליפענאל אקסידאז (PPO) איז באשטימט געווארן נאך רעאקציע מיט 2.2 מל פון 100 mM סאדיום פאספאט בופער (pH 6.0), 100 μl פון גוואיאקאל (TCI כעמיקאלן, פארטלאנד, ארעגאן, USA) און 100 μl פון 12 mM H2O2. די מעטאד איז לייכט געענדערט געווארן פון (על-נאגאר עט אל., 2023; אסמאן עט אל., 2023). די טעסט איז דורכגעפירט געווארן נאך רעאקציע מיט 3 מל פון קאטעכאל לייזונג (טהערמא סייענטיפיק כעמיקאלן, וואלטהאם, מאסאטשוסעטס, USA) (0.01 M) פריש צוגעגרייט אין 0.1 M פאספאט בופער (pH 6.0). CAT טעטיקייט איז געמאסטן געווארן דורך מאָניטאָרינג די דעקאָמפּאָזיציע פון ​​H2O2 ביי 240 נם (A240), POX טעטיקייט איז געמאסטן געווארן דורך מאָניטאָרינג די פאַרגרעסערונג אין אַבסאָרבאַנס ביי 436 נם (A436), און PPO טעטיקייט איז געמאסטן געווארן דורך רעקאָרדינג אַבסאָרבאַנס פלוקטואַציעס ביי 495 נם (A495) יעדע 30 סעקונדעס פֿאַר 3 מינוט ניצנדיק אַ UV-160A ספּעקטראָפאָטאָמעטער (Shimadzu, יאַפּאַן).
רעאַל-צייט RT-PCR איז גענוצט געוואָרן צו דעטעקטירן די טראַנסקריפּט לעוועלס פון דריי אַנטיאַקסאַדאַנט-פֿאַרבונדענע גענעס, אַרייַנגערעכנט פּעראָקסיסאָמאַל קאַטאַלאַזע (PvCAT1; GenBank אַקסעסיאָן נומ. KF033307.1), סופּעראָקסייד דיסמוטאַזע (PvSOD; GenBank אַקסעסיאָן נומ. XM_068639556.1), און גלוטאַטהיאָן רעדוקטאַזע (PvGR; GenBank אַקסעסיאָן נומ. KY195009.1), אין בין בלעטער (די צווייטע און דריטע גאָר אַנטוויקלטע בלעטער פֿון אויבן) 72 שעה נאָך דער לעצטער באַהאַנדלונג. בקיצור, RNA איז אפגעזונדערט געוואָרן מיט Simply P Total RNA Extraction Kit (קאַט. נומ. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, כינע) לויטן פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט. דערנאָך איז cDNA סינטעזירט געוואָרן מיט TOP script™ cDNA Synthesis Kit לויט די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט. די פּריימער סיקוואַנסן פֿון די אויבן דריי גענעס זענען ליסטעד אין סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע S3. PvActin-3 (GenBank אַקסעסיע נומער: XM_068616709.1) איז גענוצט געוואָרן ווי דער הויז-האַנדלינג גען און די רעלאַטיווע גען אויסדרוק איז קאַלקולירט געוואָרן מיטן 2-ΔΔCT מעטאָד (ליוואַק און שמיטגען, 2001). אַקטין סטאַביליטעט אונטער ביאָטישן דרוק (אומקאָמפּאַטיבלע אינטעראַקציע צווישן געוויינטלעכע לעגיומז און דעם אַנטראַקנייז פונגוס Colletotrichum lindemuthianum) און אַביאָטישן דרוק (טריקעניש, זאַלץ, נידעריקע טעמפּעראַטור) איז דעמאָנסטרירט געוואָרן (באָרגעס עט אַל., 2012).
מיר האָבן אָנפאנגס דורכגעפירט אַ גענאָם-ברייטע אין סיליקאָ אַנאַליז פון אָקסאַלאָאַסעטאַט אַצעטילהידראָלאַז (OAH) פּראָטעאינען אין S. sclerotiorum ניצנדיק דעם פּראָטעין-פּראָטעין BLAST געצייַג (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). בקיצור, מיר האָבן גענוצט OAH פון Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; טאַקסיד: 1191702; GenBank אַקסעסיאָן נומער XP_040799428.1; 342 אַמינאָ זויערן) און Penicillium lagena (PlOAH; טאַקסיד: 94218; GenBank אַקסעסיאָן נומער XP_056833920.1; 316 אַמינאָ זויערן) ווי אָנפֿרעג סיקוואַנסן צו מאַפּירן דעם האָמאָלאָגישן פּראָטעין אין S. sclerotiorum (טאַקסיד: 5180). BLASTp איז דורכגעפירט געוואָרן קעגן די לעצטנס בנימצא S. sclerotiorum גענאָם דאַטן אין GenBank אויף דער נאַציאָנאַלער צענטער פֿאַר ביאָטעכנאָלאָגיע אינפֿאָרמאַציע (NCBI) וועבזייטל, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
דערצו, די פאראויסגעזאגטע OAH גענע פון ​​S. sclerotiorum (SsOAH) און די עוואלוציאנערע אנאליז און פילאגענעטישע בוים פון AfOAH פון A. fijiensis CBS 313.89 און PlOAH פון P. lagena זענען געווארן אויסגערעכנט ניצנדיק די מאקסימום ליקעליהאָאָד מעטאָדע אין MEGA11 (Tamura et al., 2021) און די JTT מאַטריץ-באזירטע מאָדעל (Jones et al., 1992). דער פילאגענעטישע בוים איז געווארן קאמבינירט מיט די מערפאכיגע אויסריכטונג אנאליז פון פּראָטעין סיקווענסעס פון אלע פאראויסגעזאגטע OAH גענעס (SsOAH) פון S. sclerotiorum און די קווערי סיקווענס ניצנדיק די Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos און Agarwala, 2007). דערצו, די בעסטע צופּאַסנדיקע אַמינאָ זויער סיקוואַנסן פון SsOAH פון S. sclerotiorum זענען געווען אַליינד מיט די קווערי סיקוואַנסן (AfOAH און PlOAH) (Larkin et al., 2007) ניצנדיק ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), און קאָנסערווירטע געגנטן אין דער אַליינמענט זענען וויזואַליזירט געוואָרן ניצנדיק דעם ESPript טול (ווערסיע 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
דערצו, די פאראויסגעזאגטע פונקציאָנעלע רעפּרעזענטאַטיווע דאָמעינען און קאָנסערווירטע זייטלעך פון S. sclerotiorum SsOAH זענען אינטעראַקטיוו קלאַסיפיצירט געוואָרן אין פֿאַרשידענע משפּחות ניצנדיק דעם InterPro געצייַג (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (בלום et al., 2021). צום סוף, דריי-דימענסיאָנעלע (3D) סטרוקטור מאָדעלירונג פון די פאראויסגעזאגטע S. sclerotiorum SsOAH איז דורכגעפירט געוואָרן ניצנדיק דעם Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 סערווער ווערסיע 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) און וואַלידירט ניצנדיק דעם SWISS-MODEL סערווער (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). די פאָרויסגעזאָגטע דריי-דימענסיאָנאַלע סטרוקטורן (PDB פֿאָרמאַט) זענען אינטעראַקטיוו וויזואַליזירט געוואָרן ניצנדיק דעם UCSF-Chimera פּעקל (ווערסיע 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
קוואַנטיטאַטיווע רעאַל-צייט פלאָרעסענס PCR איז גענוצט געוואָרן צו באַשטימען דעם טראַנסקריפּציאָנעלן לעוועל פון אָקסאַלאָאַסעטאַט אַצעטילהידראָלאַז (SsOAH; GenBank אַקסעסיע נומער: XM_001590428.1) אין די מיסעליע פון ​​סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום. בקיצור, S. סקלעראָטיאָרום איז געוואָרן אינאקולירט אין אַ פלעשל מיט PDB און געשטעלט אין אַ שאָקלנדיקן אינקובאַטאָר (מאָדעל: I2400, ניו בראַנזוויק סייענטיפיק קאָו., עדיסאָן, ניו דזשערזי, USA) ביי 25 ± 2 °C פֿאַר 24 שעה ביי 150 רפּם און אין קאָנסטאַנטער פינצטערניש (24 שעה) צו סטימולירן מיסעליאַל וווּקס. דערנאָך, די צעלן זענען באַהאַנדלט געוואָרן מיט L-אָרניטין און דעם פונגיציד ריזאָלעקס-T ביי לעצט IC50 קאָנצענטראַציעס (בעערעך 40 און 3.2 מג/ל, ריספּעקטיוולי) און דערנאָך קאָלטיווירט פֿאַר נאָך 24 שעה אונטער די זעלבע באַדינגונגען. נאך אינקובאציע, זענען די קולטורן צענטריפוגירט געווארן ביי 2500 רפּם פאר 5 מינוט און דער סופּערנאַטאַנט (פונגאַל מיצעליום) איז געזאמלט געווארן פאר גען אויסדרוק אנאליז. ענליך, פונגאַל מיצעליום איז געזאמלט געווארן ביי 0, 24, 48, 72, 96, און 120 שעה נאך דער אינפעקציע פון ​​אינפעקטירטע פלאנצן וואס האבן געשאפן ווייסע פורעם און וואטענע מיצעליום אויף דער ייבערפלאך פון אינפעקטירטע געוועבן. RNA איז עקסטראַקטירט געווארן פון דעם פונגאַל מיצעליום און דערנאך איז cDNA סינטעזירט געווארן ווי באשריבן אויבן. די פּריימער סיקוואַנסן פאר SsOAH זענען ליסטעד אין סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע S3. SsActin (GenBank אַקסעסיאָן נומער: XM_001589919.1) איז גענוצט געווארן אלס דער הויזקיפּינג גען, און רעלאַטיווע גען אויסדרוק איז קאַלקולירט געווארן ניצנדיק די 2-ΔΔCT מעטאָדע (ליוואַק און שמיטגען, 2001).
אקסאַלישע זויער איז באַשטימט געוואָרן אין קאַרטאָפל דעקסטראָז בראָט (PDB) און פלאַנצן מוסטערן מיט דעם פונגוס פּאַטאַגען סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום לויט דער מעטאָדע פון ​​קסו און זשאַנג (2000) מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס. בקיצור, S. סקלעראָטיאָרום איזאָלאַטן זענען אינאקולירט געוואָרן אין פלאַשן מיט PDB און דערנאָך קאָלטיווירט אין אַ שאָקלנדיקן אינקובאַטאָר (מאָדעל I2400, ניו בראַנזוויק סייענטיפיק קאָו., עדיסאָן, ניו דזשערזי, USA) ביי 150 רפּם ביי 25 ± 2 °C פֿאַר 3-5 טעג אין קאָנסטאַנטער פינצטערניש (24 שעה) צו סטימולירן מיסעליאַל וווּקס. נאָך אינקובאַציע, איז די פונגוס קולטור ערשט געפילטערט געוואָרן דורך וואַטמאַן #1 פילטער פּאַפּיר און דערנאָך סענטריפוגירט ביי 2500 רפּם פֿאַר 5 מינוט צו באַזייַטיקן רעשט מיסעליום. דער סופּערנאַטאַנט איז געזאַמלט און געהאלטן ביי 4°C פֿאַר ווייטערדיקע קוואַנטיטאַטיווע באַשטימונג פון אָקסאַלאַט. פֿאַר דער צוגרייטונג פון פלאַנצן מוסטערן, זענען אַרום 0.1 ג פון פלאַנצן געוועב פראַגמענטן עקסטראַקטעד דריי מאָל מיט דיסטילירט וואַסער (2 מל יעדעס מאָל). די מוסטערן זענען דעמאָלט סענטריפוגירט געוואָרן ביי 2500 רפּם פֿאַר 5 מינוט, דער סופּערנאַטאַנט איז טרוקן פֿילטערירט געוואָרן דורך וואַטמאַן נומער 1 פֿילטער פּאַפּיר און געזאַמלט פֿאַר ווייטערדיקע אַנאַליז.
פֿאַר קוואַנטיטאַטיווער אַנאַליז פֿון אָקסאַליק זויער, איז די רעאַקציע־מישונג צוגעגרייט געוואָרן אין אַ גלאָז־פֿאַרמאַכטן רער אין דער פֿאָלגנדיקער סדר: 0.2 מל פֿון מוסטער (אָדער PDB קולטור־פֿילטראַט אָדער אָקסאַליק זויער־סטאַנדאַרט־לייזונג), 0.11 מל פֿון בראָמאָפֿענאָל בלוי (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, פּיטסבורג, פּענסילוועניע, USA), 0.198 מל פֿון 1 M שוועבל־זויער (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, קאַיראָ, מצרים) און 0.176 מל פֿון 100 mM פּאָטאַסיום־דיכראָמאַט (K2Cr2O7; TCI chemicals, פּאָרטלאַנד, אָרעגאָן, USA), און דערנאָך איז די לייזונג פֿאַרדיןנט געוואָרן צו 4.8 מל מיט דיסטילירט וואַסער, שטאַרק געמישט און גלייך געשטעלט אין אַ 60 °C וואַסער־באָד. נאָך 10 מינוט, איז די רעאַקציע אָפּגעשטעלט געוואָרן דורך צולייגן 0.5 מל פֿון נאַטריום־הידראָקסייד־לייזונג (NaOH; 0.75 M). די אַבסאָרבאַנס (A600) פון דער רעאַקציע געמיש איז געמאָסטן געוואָרן ביי 600 נאַנאָמעטער מיט אַ UV-160 ספּעקטראָפאָטאָמעטער (Shimadzu Corporation, יאַפּאַן). PDB און דיסטילירט וואַסער זענען גענוצט געוואָרן ווי קאָנטראָלן פֿאַר דער קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​קולטור פילטראַטן און פלאַנצן מוסטערן, ריספּעקטיוולי. די אָקסאַליק זויער קאָנצענטראַציעס אין די קולטור פילטראַטן, אויסגעדריקט ווי מיקראָגראַמס פון אָקסאַליק זויער פּער מיליליטער פון PDB מעדיום (μg.mL−1), און אין די בלאַט עקסטראַקטן, אויסגעדריקט ווי מיקראָגראַמס פון אָקסאַליק זויער פּער גראַם פון פריש וואָג (μg.g−1 FW), זענען באַשטימט געוואָרן מיט אַן אָקסאַליק זויער קאַליבראַציע קורווע (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
איבער דער גאנצער שטודיע, זענען אלע עקספערימענטן דיזיינט געווארן אין א גאנצן ראנדאמיזירטן דיזיין (CRD) מיט זעקס ביאלאגישע רעפליקאטן פער באהאנדלונג און פינף טאפלעך פער ביאלאגישן רעפליקאט (צוויי פלאנצן פער טאפ) סיידן אנדערש געזאגט. ביאלאגישע רעפליקאטן זענען אנאליזירט געווארן אין דופליקאט (צוויי טעכנישע רעפליקאטן). טעכנישע רעפליקאטן זענען גענוצט געווארן צו קאנטראלירן די רעפראדוסירבארקייט פון דעם זעלבן עקספערימענט אבער זענען נישט גענוצט געווארן אין דער סטאטיסטישער אנאליז צו פארמיידן פאלשע רעפליקאטן. דאטן זענען סטאטיסטיש אנאליזירט געווארן מיט אנאליז פון וועריאנץ (ANOVA) נאכגעפאלגט דורך טוקי-קראמער האנליסטיש באדייטנדיקער חילוק (HSD) טעסט (p ≤ 0.05). פאר אין וויטרא עקספערימענטן, זענען IC50 און IC99 ווערטן אויסגערעכנט געווארן מיט דעם פראביט מאדעל און 95% קאנפידענץ אינטערוואלן זענען אויסגערעכנט געווארן.
א סך הכל פון פיר איזאלאטן זענען געזאמלט געווארן פון פארשידענע סויבין פעלדער אין על גאביא גאווערניאראט, מצרים. אויף PDA מעדיום, האבן אלע איזאלאטן פראדוצירט קרעמעדיגע ווייסע מיצעליום וואס האט זיך שנעל פארוואנדלט אין וואטע-ווייס (פיגור 1א) ​​און דערנאך בייזש אדער ברוין ביים סקלעראטיום שטאפל. סקלעראטיע זענען געווענליך געדיכט, שווארץ, קוגל-פארביק אדער אומגלייך אין פארעם, 5.2 ביז 7.7 מ"מ לאנג און 3.4 ביז 5.3 מ"מ אין דיאמעטער (פיגור 1ב). כאטש פיר איזאלאטן האבן אנטוויקלט א מארגינאלן מוסטער פון סקלעראטיע ביים ברעג פונעם קולטור מעדיום נאך 10-12 טעג אינקובאציע ביי 25 ± 2 °C (פיגור 1א), איז די צאל סקלעראטיע פער טעלער געווען באדייטנד אנדערש צווישן זיי (P < 0.001), מיט איזאלאט 3 מיט די העכסטע צאל סקלעראטיע (32.33 ± 1.53 סקלעראטיע פער טעלער; פיגור 1ק). אזוי אויך, איזאלאט #3 האט פראדוצירט מער אקסאלישע זויער אין PDB ווי אנדערע איזאלאטן (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; פיג. 1D). איזאלאט #3 האט געוויזן טיפישע מארפאָלאָגישע און מיקראָסקאָפּישע קעראַקטעריסטיקס פון די פיטאָפּאַטאָגענע פונגוס סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום. למשל, אויף PDA, זענען קאָלאָניעס פון איזאלאט #3 געוואקסן שנעל, זענען געווען קרעם ווייס (פיגור 1A), פאַרקערט בייזש אָדער ליכטיק לאַקס געל-ברוין, און האָבן געברויכט 6-7 טעג ביי 25 ± 2°C צו גאָר דעקן די ייבערפלאַך פון אַ 9 סענטימעטער דיאַמעטער טעלער. באַזירט אויף די אויבן מאָרפאָלאָגישע און מיקראָסקאָפּישע קעראַקטעריסטיקס, איזאלאט #3 איז געווען אידענטיפיצירט ווי סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום.
פיגור 1. קעראַקטעריסטיקס און פּאַטאַגעניסיטי פון S. sclerotiorum איזאָלאַטן פון געוויינטלעכע לעגיום געוויקסן. (א) מיסעליאַל וווּקס פון פיר S. sclerotiorum איזאָלאַטן אויף PDA מעדיום, (ב) סקלעראָטיאַ פון פיר S. sclerotiorum איזאָלאַטן, (C) נומער פון סקלעראָטיאַ (פּער טעלער), (ד) אָקסאַליק זויער סעקרעשאַן אויף PDB מעדיום (μg.mL−1), און (E) קראַנקייט שטרענגקייט (%) פון פיר S. sclerotiorum איזאָלאַטן אויף סאַסעפּטאַבאַל קאמערציעלע לעגיום קולטיוואַר גיזאַ 3 אונטער גרינכאַוס באדינגונגען. ווערטן רעפּרעזענטירן די דורכשניטלעך ± SD פון פינף ביאָלאָגישע רעפּליקאַטעס (n = 5). פאַרשידענע אותיות ווייַזן סטאַטיסטיש באַטייַטיק דיפעראַנסיז צווישן באַהאַנדלונגען (p < 0.05). (F–H) טיפּיש ווייַס פורעם סימפּטאָמס ארויס אויף אויבן-ערד סטעמס און סיליקאָוז, ריספּעקטיוולי, 10 טעג נאָך ינאָקולאַטיאָן מיט איזאָלאַט #3 (dpi). (I) עוואָלוציאָנערע אַנאַליז פון דער אינערלעכער טראַנסקריבירטער ספּייסער (ITS) ראַיאָן פון S. sclerotiorum איזאָלאַט #3 איז דורכגעפירט געוואָרן מיט דער מאַקסימום ליקעליהאָאָד מעטאָדע און פאַרגליכן מיט 20 רעפערענץ איזאָלאַטן/שטאַמען באַקומען פון דער נאַציאָנאַלער צענטער פֿאַר ביאָטעכנאָלאָגיע אינפֿאָרמאַציע (NCBI) דאַטאַבייס (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). די נומערן העכער די קלאַסטערינג ליניעס ווייַזן די ראַיאָן קאַווערידזש (%), און די נומערן אונטער די קלאַסטערינג ליניעס ווייַזן די צווייַג לענג.
ווייטער, צו באשטעטיגן די פּאַטאַגעניסיטי, זענען פיר באקומענע S. sclerotiorum איזאָלאַטן גענוצט געוואָרן צו אינאָקולירן די סאַסעפּטאַבאַל קאמערציעלע בין קאַלטיוואַר גיזאַ 3 אונטער גרינכאַוס באדינגונגען, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט קאָך ס פּאָסטולאַטן (פיגור 1E). כאָטש אַלע די באקומענע פונגאַל איזאָלאַטן זענען געווען פּאַטאַגעניק און קענען ינפעקטירן די גרינע בין (cv. Giza 3), וואָס האָט געפֿירט טיפּישע ווייסע פורעם סימפּטאָמס אויף אַלע אויבן-ערד טיילן (פיגור 1F), ספּעציעל אויף די סטעמס (פיגור 1G) און פּאָדס (פיגור 1H) ביי 10 טעג נאָך ינאָקולאַציע (dpi), איזאָלאַט 3 איז געווען די מערסט אַגרעסיוו איזאָלאַט אין צוויי אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. איזאָלאַט 3 האט געהאט די העכסטע קראַנקייט שטרענגקייט (%) אויף בין פלאַנצן (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, און 76.7 ± 3.1 ביי 7, 14, און 21 טעג נאָך-ינפעקציע, ריספּעקטיוולי; פיגור 1F).
די אידענטיפיקאציע פון ​​דעם מערסטן אינוואזיווער S. sclerotiorum איזאלאט #3 איז ווייטער באשטעטיקט געווארן באזירט אויף אינערליכער טראַנסקריבירטער ספּייסער (ITS) סיקווענסינג (פיגור 1I). פילאגענעטישע אנאליז צווישן איזאלאט #3 און 20 רעפערענץ איזאלאטן/שטאמען האט געוויזן הויכע ענלעכקייט (>99%) צווישן זיי. עס איז ווערט צו באמערקן אז דער S. sclerotiorum איזאלאט #3 (533 bp) האט א הויכע ענלעכקייט צום אמעריקאנער S. sclerotiorum איזאלאט LPM36 איזאלירט פון טרוקענע ערבעס זאמען (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) און דעם כינעזישן S. sclerotiorum איזאלאט YKY211 (GenBank accession number OR206374.1; 548 bp), וואס פאראורזאכט וויאלעטע (Matthiola incana) סטעם פוילן, אלע פון ​​וועלכע זענען גרופירט באזונדער ביים שפיץ פונעם דענדראגראם (פיגור 1I). די נייע סיקוואַנס איז דעפּאָנירט געוואָרן אין דער NCBI דאַטאַבאַזע און גערופֿן "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (GenBank אַקסעסיע נומער PV202792). מען קען זען אַז איזאָלאַט 3 איז דער מערסט ינווייסיוו איזאָלאַט; דעריבער, איז דער איזאָלאַט אויסגעקליבן געוואָרן פֿאַר שטודיע אין אַלע ווייטערדיקע עקספּערימענטן.
די אַנטיבאַקטיריעלע טעטיקייט פון דעם דיאַמין L-אָרניטין (Sigma-Aldrich, דאַרמשטאַט, דייטשלאַנד) ביי פאַרשידענע קאָנצענטראַציעס (12.5, 25, 50, 75, 100 און 125 מג/ל) קעגן S. sclerotiorum איזאָלאַט 3 איז געוואָרן אויסגעפאָרשט אין וויטראָ. עס איז כדאי צו באַמערקן אַז L-אָרניטין האָט אויסגעאיבט אַן אַנטיבאַקטיריעלע ווירקונג און ביסלעכווייַז געשטערט דעם ראַדיאַלן וואוקס פון S. sclerotiorum היפֿע אין אַ דאָז-אָפּהענגיקן שטייגער (פיגור 2A, B). ביי דער העכסטער קאָנצענטראַציע וואָס איז געטעסט געוואָרן (125 מג/ל), האָט L-אָרניטין געוויזן די העכסטע מיסעליאַל וואוקס אינהיביציע קורס (99.62 ± 0.27%; פיגור 2B), וואָס איז געווען עקוויוואַלענט צו דעם קאמערציעלן פונגיציד Rizolex-T (אינהיביציע קורס 99.45 ± 0.39%; פיגור 2C) ביי דער העכסטער קאָנצענטראַציע וואָס איז געטעסט געוואָרן (10 מג/ל), וואָס ווײַזט אויף ענלעכע עפיקאַסי.
פיגור 2. אין וויטראָ אַנטיבאַקטיריעלע טעטיקייט פון L-אָרניטין קעגן סקלעראָטיניאַ סקלעראָטיאָרום. (א) פאַרגלייַך פון דער אַנטיבאַקטיריעלע טעטיקייט פון פאַרשידענע קאָנצענטראַציעס פון L-אָרניטין קעגן S. סקלעראָטיאָרום מיטן קאמערציעלן פונגיציד ריזאָלעקס-ט (10 מג/ל). (ב, ג) אינהיביציע קורס (%) פון S. סקלעראָטיאָרום מיסעליאַל וווּקס נאָך באַהאַנדלונג מיט פאַרשידענע קאָנצענטראַציעס פון L-אָרניטין (12.5, 25, 50, 75, 100 און 125 מג/ל) אָדער ריזאָלעקס-ט (2, 4, 6, 8 און 10 מג/ל), ריספּעקטיוולי. ווערטן רעפּרעזענטירן דעם דורכשניט ± SD פון פינף ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן (n = 5). פאַרשידענע אותיות באַצייכענען סטאַטיסטישע אונטערשיידן צווישן באַהאַנדלונגען (p < 0.05). (ד, ה) פּראָביט מאָדעל רעגרעסיע אַנאַליז פון L-אָרניטין און קאמערציעלן פונגיציד ריזאָלעקס-ט, ריספּעקטיוולי. די פּראָביט מאָדעל רעגרעסיע ליניע ווערט געוויזן ווי אַ גאַנצע בלויע ליניע, און די קאָנפידענץ אינטערוואַל (95%) ווערט געוויזן ווי אַ געשטריכלטע רויטע ליניע.
דערצו, איז דורכגעפירט געווארן פּראָביט רעגרעסיע אנאליז און די קארעספאנדירנדע פּלאָץ ווערן געוויזן אין טאַבעלע 1 און פיגורן 2D,E. בקיצור, דער אקצעפטירבארער סלאָופּ ווערט (y = 2.92x − 4.67) און פארבונדענע באַדייטנדיקע סטאַטיסטיק (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 און p < 0.0001; פיגור 2D) פון L-אָרניטין האבן געוויזן א פארשטארקטע אנטי-פונגאַל טעטיקייט קעגן S. sclerotiorum קאמפערד צו דעם קאמערציעלן פונגיסיד Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 און p < 0.0001) (טאַבעלע 1).
טאַבעלע 1. ווערטן פון האַלב-מאַקסימום אינהיביטאָרישע קאָנצענטראַציע (IC50) און IC99 (מג/ל) פון L-אָרניטין און קאמערציעלע פונגיציד "ריזאָלעקס-T" קעגן S. סקלעראָטיאָרום.
אינגאנצן, האט L-ארניטין (250 מג/ל) באדייטנד פארקלענערט די אנטוויקלונג און שטרענגקייט פון ווייסע פורעם אויף באהאנדלטע געוויינטלעכע בין פלאנצן אין פארגלייך מיט נישט באהאנדלטע S. sclerotiorum-אינפעקטירטע פלאנצן (קאנטראל; פיגור 3A). בקיצור, כאטש די קראנקהייט שטרענגקייט פון נישט באהאנדלטע אינפעקטירטע קאנטראל פלאנצן האט זיך ביסלעכווייז פארגרעסערט (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, און 92.33 ± 3.06%), האט L-ארניטין באדייטנד פארקלענערט די קראנקהייט שטרענגקייט (%) איבערן גאנצן עקספערימענט (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, און 26.36 ± 3.07) ביי 7, 14, און 21 טעג נאך דער באהאנדלונג (dpt), בהתאמה (פיגור 3A). אזוי אויך, ווען S. sclerotiorum-אינפעקטירטע בין פלאנצן זענען באהאנדלט געווארן מיט 250 מג/ל L-ארניטין, איז די שטח אונטער דער קראנקהייט פראגרעסיע קורווע (AUDPC) געפאלן פון 1274.33 ± 33.13 אין דער נישט-באהאנדלטער קאנטראל צו 281.03 ± 7.95, וואס איז געווען עטוואס נידעריגער ווי די פאזיטיוו קאנטראל 50 מג/ל Rizolex-T פונגיציד (183.61 ± 7.71; פיג. 3B). די זעלבע טענדענץ איז באמערקט געווארן אין דעם צווייטן עקספערימענט.
פיג. 3. ווירקונג פון עקזאגענעזער אויפטראָג פון L-אָרניטין אויף דער אַנטוויקלונג פון ווייסער פוילקייט פון געוויינטלעכע בינען געפֿירט דורך Sclerotinia sclerotiorum אונטער גרינכאַוס באדינגונגען. (א) קראַנקייט פּראָגרעס קורווע פון ​​ווייסער פורעם פון געוויינטלעכע בינען נאָך באַהאַנדלונג מיט 250 מג/ל L-אָרניטין. (ב) שטח אונטער דער קראַנקייט פּראָגרעס קורווע (AUDPC) פון ווייסער פורעם פון געוויינטלעכע בינען נאָך באַהאַנדלונג מיט L-אָרניטין. ווערטן רעפּרעזענטירן די דורכשניט ± SD פון פינף ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן (n = 5). פֿאַרשידענע אותיות באַצייכענען סטאַטיסטיש באַדייטנדיקע אונטערשיידן צווישן באַהאַנדלונגען (p < 0.05).
עקסאָגענע אַפּליקאַציע פון ​​250 מג/ל ל-אָרניטין האָט ביסלעכווייַז געוואַקסן די הייך פון די פלאַנצן (פיגור 4A), די צאָל צווייגן פּער פלאַנצ (פיגור 4B), און די צאָל בלעטער פּער פלאַנצ (פיגור 4C) נאָך 42 טעג. כאָטש דער קאמערציעלער פונגיציד ריזאָלעקס-T (50 מג/ל) האָט געהאַט די גרעסטע ווירקונג אויף אַלע שטודירטע נוטרישאַנעלע פּאַראַמעטערס, האָט עקסאָגענע אַפּליקאַציע פון ​​250 מג/ל ל-אָרניטין געהאַט די צווייט גרעסטע ווירקונג קאַמפּערד צו די נישט-באַהאַנדלטע קאָנטראָלן (פיגורן 4A–C). אויף דער אנדערער האַנט, L-אָרניטין באַהאַנדלונג האט נישט געהאט קיין באַדייטנדיקע ווירקונג אויף דעם אינהאַלט פון פאָטאָסינטעטישע פּיגמענטן כלאָראָפיל a (פיגור 4D) און כלאָראָפיל b (פיגור 4E), אָבער האט אַ ביסל געוואקסן דעם גאַנצן קאַראָטענאָיד אינהאַלט (0.56 ± 0.03 מג/ג פר wt) קאַמפּערד צו דער נעגאַטיווער קאָנטראָל (0.44 ± 0.02 מג/ג פר wt) און פּאָזיטיווער קאָנטראָל (0.46 ± 0.02 מג/ג פר wt; פיגור 4F). אין אַלגעמיין, ווײַזן די רעזולטאַטן אַז L-אָרניטין איז נישט פיטאָטאָקסיש צו באַהאַנדלטע לעגומי און קען אפילו סטימולירן זייער וווּקס.
פיג. 4. ווירקונג פון עקזאגענע L-ארניטין אפליקאציע אויף וואוקס אייגנשאפטן און פאטאסינטעטישע פיגמענטן פון בין בלעטער אינפעקטירט מיט סקלעראטיניע סקלעראטיארום אונטער גרינכאַוס באדינגונגען. (א) פלאנץ הייך (cm), (ב) צאל צווייגן פער פלאנץ, (ג) צאל בלעטער פער פלאנץ, (ד) כלאָראָפיל a אינהאַלט (מג ג-1 פר wt), (ה) כלאָראָפיל ב אינהאַלט (מג ג-1 פר wt), (ו) גאַנץ קאַראָטענאָיד אינהאַלט (מג ג-1 פר wt). ווערטן זענען די דורכשניטלעך ± SD פון פינף ביאָלאָגישע רעפּליקאַטעס (n = 5). פאַרשידענע אותיות ווייַזן סטאַטיסטיש באַטייַטיק חילוק צווישן באַהאַנדלונגען (p < 0.05).
אין סיטו היסטאכעמישע לאקאליזאציע פון ​​רעאקטיווע זויערשטאף מינים (ROS; אויסגעדריקט ווי וואסערשטאף פעראקסייד [H2O2]) און פרייע ראדיקאלן (אויסגעדריקט ווי סופעראקסייד אניאנען [O2•−]) האט געוויזן אז עקזאגענע אנווענדונג פון L-ארניטין (250 מג/ל) האט באדייטנד פארקלענערט די אקומולאציע פון ​​H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; פיג. 5A) און O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; פיג. 5B) קאמפערד צו דער אקומולאציע פון ​​ביידע נישט-באהאנדלטע אינפעקטירטע פלאנצן (173.31 ± 12.06 און 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, בהתאמה) און פלאנצן באהאנדלט מיט 50 מג/ל פון דעם קאמערציעלן פונגיציד ריזאלעקס-T (170.12 ± 9.50 און 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, בהתאמה) ביי 72 שעה. הויכע לעוועלס פון H2O2 און O2•− האבן זיך אנגעזאמלט אונטער hpt (פיגור 5A, B). ענליך, TCA-באזירטע מאַלאָנדיאַלדעכייד (MDA) אַסיי האט געוויזן אז S. sclerotiorum-אינפעקטירטע בין פלאַנצן האבן אנגעזאמלט העכערע לעוועלס פון MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) אין זייערע בלעטער (פיגור 5C). אבער, עקסאָגענע אַפּליקאַציע פון ​​L-אָרניטין האט באַדייטנד פארקלענערט ליפּיד פּעראַקסאַדיישאַן, ווי באַוויזן דורך די פאַרקלענערונג אין MDA אינהאַלט אין באַהאַנדלטע פלאַנצן (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
פיג. 5. ווירקונג פון עקזאגענע L-ארניטין אפליקאציע אויף הויפט מארקערס פון אקסידאטיוו סטרעס און נישט-ענזימאטישע אנטיאקסידאנט פארטיידיגונג מעקאניזמען אין בין בלעטער אינפעקטירט מיט S. sclerotiorum 72 שעה נאך אינפעקציע אונטער גרינהויז באדינגונגען. (א) וואסערשטאף פעראקסייד (H2O2; nmol g−1 FW) ביי 72 hpt, (ב) סופעראקסייד אניאן (O2•−; nmol g−1 FW) ביי 72 hpt, (C) מאלאנדיאלדאהייד (MDA; nmol g−1 FW) ביי 72 hpt, (D) גאנצע לייזלעכע פענאלן (mg GAE g−1 FW) ביי 72 hpt, (E) גאנצע לייזלעכע פלאוואנאידן (mg RE g−1 FW) ביי 72 hpt, (F) גאנצע פרייע אמינא זויערן (mg g−1 FW) ביי 72 hpt, און (G) פראלין אינהאלט (mg g−1 FW) ביי 72 hpt. ווערטן רעפּרעזענטירן דעם דורכשניט ± סטאַנדאַרט דעוויאַציע (דורכשניט ± SD) פון 5 ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן (n = 5). פֿאַרשידענע אותיות ווײַזן סטאַטיסטיש באַדײַטנדיקע אונטערשיידן צווישן באַהאַנדלונגען (p < 0.05).