א דאנק פארן באזוכן Nature.com. די ווערסיע פון ​​בראַוזער וואָס איר ניצט האט באַגרענעצטע CSS שטיצע. פֿאַר די בעסטע רעזולטאַטן, רעקאָמענדירן מיר אַז איר זאָלט ניצן אַ נייערע ווערסיע פון ​​אייער בראַוזער (אָדער דיאַקטיווירן קאָמפּאַטיביליטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). אין דער דערווייל, צו זיכער מאַכן אָנגייענדיקע שטיצע, ווייַזן מיר דעם וועבזייטל אָן סטיילינג אָדער דזשאַוואַסקריפּט.
פּראָפּיאָניק זויער (PPA) ווערט גענוצט צו שטודירן די ראָלע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע אין נעוראָדעוועלאָפּמענטאַל דיסאָרדערס ווי אַוטיזם ספּעקטרום דיסאָרדער. PPA איז באַקאַנט צו צעשטערן מיטאָטשאָנדריאַל ביאָגענעסיס, מעטאַבאָליזאַם און טורנאָוווער. אָבער, די ווירקונגען פון PPA אויף מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק, פישאַן און פוסיאָן בלייבן פּראָבלעמאַטיש רעכט צו דער קאָמפּלעקסער טעמפּאָראַלער נאַטור פון די מעקאַניזמען. דאָ, מיר נוצן קאָמפּלעמענטאַרע קוואַנטיטאַטיווע בילדגעבונג טעקניקס צו אויספאָרשן ווי PPA אַפעקטירט מיטאָטשאָנדריאַל אולטראַסטרוקטור, מאָרפאָלאָגיע און דינאַמיק אין נעוראָן-ווי SH-SY5Y סעלז. PPA (5 mM) האָט געפֿירט צו אַ באַטייטיק פאַרקלענערן אין מיטאָטשאָנדריאַל שטח (p < 0.01), פערעט דיאַמעטער און אַרומקרייז (p < 0.05), און שטח 2 (p < 0.01). מיטאָטשאָנדריאַל געשעעניש לאָקאַטאָר אַנאַליז האָט געוויזן אַ באַטייטיק פאַרגרעסערונג (p < 0.05) אין פישאַן און פוסיאָן געשעענישן, דערמיט מיינטיינינג די אָרנטלעכקייט פון די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ אונטער דרוק באדינגונגען. דערצו, די mRNA אויסדרוק פון cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) און OPA1 (p < 0.05) איז געווען באדייטנד פארקלענערט. 01). דאס אילוסטרירט די רעמאדעלינג פון מיטאכאנדריעלער מאָרפאָלאָגיע, ביאָגענעסיס און דינאַמיק צו האַלטן פונקציע אונטער סטרעס באדינגונגען. אונדזערע דאַטן צושטעלן נייע איינבליקן אין די ווירקונגען פון PPA אויף מיטאכאנדריעלער דינאַמיק און אונטערשטרייכן די נוצלעכקייט פון בילדגעבונג טעקניקס פֿאַר שטודירן די קאָמפּלעקסע רעגולאַטאָרישע מעקאַניזמען ינוואַלווד אין מיטאכאנדריעלער סטרעס רעספּאָנסעס.
מיטאָטשאָנדריאַ זענען אינטעגראַלע באַטייליקטע אין אַ פאַרשיידנקייט פון צעלולאַרע פונקציעס ווייטער פון זייערע טיפּישע ראָלעס אין ענערגיע פּראָדוקציע און ביאָסינטעז. מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאָליזם איז אַ שליסל רעגולאַטאָר פון קאַלסיום סיגנאַלינג, מעטאַבאַליק און רעדאָקס כאָומיאָסטאַסיס, ינפלאַמאַטאָרי סיגנאַלינג, עפּיגענעטישע מאָדיפיקאַציעס, צעל פּראָליפעראַציע, דיפערענציאַציע און פּראָגראַמירט צעל טויט1. אין באַזונדער, מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאָליזם איז קריטיש פֿאַר נעוראָנאַל אַנטוויקלונג, ניצל און פונקציע און איז ברייט ימפּליקייטיד אין פאַרשידענע מאַניפעסטאַטיאָנס פון נעוראָפּאַטהאָלאָגי2,3,4.
איבער די לעצטע צען יאר, איז מעטאבאלישער סטאטוס ארויסגעקומען אלס א צענטראלער רעגולאטאר פון נעוראגענעזיס, דיפערענציאציע, מאטוראציע און פלאסטיסיטי5,6. לעצטנס, זענען מיטאכאנדריעלע מארפאלאגיע און דינאמיק געווארן באזונדערס וויכטיגע קאמפאנענטן פון מיטאזיס, א דינאמישער פראצעס וואס האלט א בעקן פון געזונטע מיטאכאנדריע אין צעלן. מיטאכאנדריעלע דינאמיק ווערט רעגולירט דורך קאמפלעקסע אינטער-דעפענדענדע וועגן וואס גייען פון מיטאכאנדריעלע ביאגענעזיס און ביאענערגעטיקס ביז מיטאכאנדריעלע פיישאן, פיוזשאן, טראנספארט און קלירענס7,8. א שטערונג פון יעדן פון די אינטעגראטיווע מעכאניזמען שאדט די אויפהאלטונג פון געזונטע מיטאכאנדריעלע נעטוואורקס און האט טיפע פונקציאנעלע קאנסעקווענצן פאר נעורא-אנטוויקלונג9,10. טאקע, דיסרעגולאציע פון ​​מיטאכאנדריעלע דינאמיק ווערט באמערקט אין פילע פסיכיאטרישע, נעוראדעגענעראטיווע און נעורא-אנטוויקלונגס שטערונגען, אריינגערעכנט אויטיזם ספעקטרום שטערונגען (ASD)11,12.
ASD איז אַ העטעראָגענע נעוראָדעוואַלופּאַמענטאַל דיסאָרדער מיט אַ קאָמפּלעקס גענעטישע און עפּיגענעטישע אַרכיטעקטור. די ירושה פון ASD איז אומבאַשטרייטן, אָבער די אַנדערלייינג מאָלעקולאַרע עטיאָלאָגיע בלייבט שוואַך פארשטאנען. אַקיומיאַלייטינג דאַטן פון פּרעקלינישע מאָדעלס, קלינישע שטודיעס און מולטי-אָמיקס מאָלעקולאַרע דאַטאַסעץ צושטעלן ינקריסינג זאָגן פון מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע אין ASD13,14. מיר פריער דורכגעפירט אַ גענאָם-ברייט דנאַ מעטילאַטיאָן סקרין אין אַ קאָהאָרט פון פּאַטיענץ מיט ASD און יידענטאַפייד דיפערענטשאַלי מעטילייטיד גענעס קלאַסטערד צוזאמען מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאַליק פּאַטווייז15. מיר דערנאָך געמאלדן דיפערענטשאַל מעטילאַטיאָן פון צענטראַל רעגולאַטאָרס פון מיטאָטשאָנדריאַל ביאָגענעסיס און דינאַמיק, וואָס איז געווען פארבונדן מיט געוואקסן mtDNA קאָפּיע נומער און געביטן יעראַנערי מעטאַבאַליק פּראָפיל אין ASD16. אונדזער דאַטן צושטעלן ינקריסינג זאָגן אַז מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק און כאָומיאָסטאַסיס שפּילן אַ צענטראַלע ראָלע אין די פּאַטאָפֿיזיאָלאָגי פון ASD. דעריבער, פֿאַרבעסערן די מעכאַניסטיש פארשטאנד פון די שייכות צווישן מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק, מאָרפאָלאָגיע און פונקציע איז אַ שליסל ציל פון אָנגאָינג פאָרשונג אין נעוראָלאָגישע חולאתן קעראַקטערייזד דורך צווייטיק מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע.
מאָלעקולאַרע טעקניקס ווערן אָפט גענוצט צו שטודירן די ראָלע פון ​​ספּעציפֿישע גענעס אין מיטאָטשאָנדריאַלע דרוק רעאַקציעס. אָבער, דעם צוגאַנג קען זיין באַגרענעצט דורך די פֿילפֿאַסעטיק און טעמפּאָראַל נאַטור פון מיטאָטישע קאָנטראָל מעקאַניזמען. דערצו, די דיפערענציעלע אויסדרוק פון מיטאָטשאָנדריאַלע גענעס איז אַן אומדירעקטער אינדיקאַטאָר פון פאַנגקשאַנאַל ענדערונגען, ספּעציעל ווייַל בלויז אַ באַגרענעצטע נומער פון גענעס זענען טיפּיש אַנאַלייזד. דעריבער, מער דירעקטע מעטהאָדס פֿאַר שטודירן מיטאָטשאָנדריאַלע פונקציע און ביאָענערגעטיקס זענען פארגעשטעלט געוואָרן17. מיטאָטשאָנדריאַלע מאָרפאָלאָגיע איז ענג פֿאַרבונדן מיט מיטאָטשאָנדריאַלע דינאַמיק. מיטאָטשאָנדריאַלע פאָרעם, קאָנעקטיוויטי און סטרוקטור זענען קריטיש פֿאַר ענערגיע פּראָדוקציע און מיטאָטשאָנדריאַלע און צעל ניצל5,18. דערצו, די פֿאַרשידענע קאָמפּאָנענטן פון מיטאָזיס פאָקוסירן אויף ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַלע מאָרפאָלאָגיע, וואָס קען דינען ווי נוציקע ענדפּונקטן פון מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע און צושטעלן אַ באַזע פֿאַר סאַבסאַקוואַנט מעכאַניסטישע שטודיעס.
מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע קען גלייך באַאָבאַכט ווערן מיט טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּיע (TEM), וואָס ערמעגליכט אַ דעטאַלירטע שטודיע פון ​​צעלולאַרער אולטראַסטרוקטור. TEM וויזואַליזירט גלייך די מאָרפאָלאָגיע, פאָרעם און סטרוקטור פון מיטאָטשאָנדריאַלע קריסטאַע ביי דער רעזאָלוציע פון ​​יחיד מיטאָטשאָנדריאַ, אַנשטאָט זיך צו פאַרלאָזן בלויז אויף גענע טראַנסקריפּציע, פּראָטעין אויסדרוק אָדער מיטאָטשאָנדריאַל פאַנגקשאַנאַל פּאַראַמעטערס אין צעל פּאָפּולאַציעס17,19,20. אין דערצו, TEM פאַסילאַטייץ די שטודיע פון ​​ינטעראַקשאַנז צווישן מיטאָטשאָנדריאַ און אנדערע אָרגאַנעלעס, אַזאַ ווי די ענדאָפּלאַזמיק רעטיקולום און אַוטאָפאַגאָסאָמעס, וואָס שפּילן שליסל ראָלעס אין מיטאָטשאָנדריאַל פונקציע און כאָומיאָסטאַסיס21,22. אַזוי, דאָס מאכט TEM אַ גוט סטאַרטינג פונט פֿאַר שטודירן מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע איידער פאָקוסינג אויף ספּעציפיש פּאַטווייז אָדער גענעס. ווי מיטאָטשאָנדריאַל פונקציע ווערט ינקריסינגלי באַטייַטיק צו נעוראָפּאַטאַלאַדזשי, עס איז אַ קלאָר נויט צו קענען צו גלייך און קוואַנטיטאַטיוולי שטודירן מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע און דינאַמיק אין אין וויטראָ נעוראָנאַל מאָדעלס.
אין דעם אַרטיקל, וועלן מיר אויספאָרשן מיטאָטשאָנדריאַלע דינאַמיק אין אַ נעוראָנאַל מאָדעל פון מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע אין אַוטיזם ספּעקטרום דיסאָרדער. מיר האָבן פריער געמאלדן דיפערענציעלע מעטילאַציע פון ​​פּראָפּיאָניל-CoA קאַרבאָקסילאַז ביתא (PCCB) אין ASD15, אַ סוביוניט פון די מיטאָטשאָנדריאַלע פּראָפּיאָניל-CoA קאַרבאָקסילאַזע ענזיים PCC. דיסרעגולאַציע פון ​​PCC איז באַקאַנט צו פאַרשאַפן טאַקסיק אַקיומיאַליישאַן פון פּראָפּיאָניל דעריוואַטיווז, אַרייַנגערעכנט פּראָפּיאָניק זויער (PPA)23,24,25. PPA איז געוויזן צו צעשטערן נעוראָנאַל מעטאַבאָליזאַם און ענדערן נאַטור אין וויוואָ און איז אַ געגרינדעט כייַע מאָדעל פֿאַר לערנען נעוראָדעוועלאָפּמענטאַל מעקאַניזאַמז ינוואַלווד אין ASD26,27,28. אין דערצו, PPA איז געמאלדן צו צעשטערן מיטאָטשאָנדריאַלע מעמבראַן פּאָטענציעל, ביאָגענעסיס און רעספּיראַציע אין וויטראָ און איז וויידלי געניצט צו מאָדעל מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע אין נעוראָנס29,30. אָבער, די פּראַל פון PPA-ינדוסט מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע אויף מיטאָטשאָנדריאַלע מאָרפאָלאָגיע און דינאַמיק בלייבט שוואַך פֿאַרשטאַנען.
די שטודיע ניצט קאמפלעמענטארע בילדגעבונג טעכניקן צו קוואַנטיפיצירן די ווירקונגען פון PPA אויף מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע, דינאַמיק און פונקציע אין SH-SY5Y צעלן. ערשטנס, האָבן מיר אַנטוויקלט אַ TEM מעטאָד צו וויזואַליזירן ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע און אולטראַסטרוקטור17,31,32. געגעבן די דינאַמישע נאַטור פון מיטאָטשאָנדריע33, האָבן מיר אויך געניצט מיטאָטשאָנדריאַל געשעעניש לאָקאַליזאַטאָר (MEL) אַנאַליז צו קוואַנטיפיצירן ענדערונגען אין די וואָג צווישן פישאַן און פיוזשאַן געשעענישן, מיטאָטשאָנדריאַל נומער און באַנד אונטער PPA דרוק. צום סוף, האָבן מיר אויסגעפאָרשט צי מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע און דינאַמיק זענען פֿאַרבונדן מיט ענדערונגען אין די אויסדרוק פון גענעס ינוואַלווד אין ביאָגענעסיס, פישאַן און פיוזשאַן. צוזאַמען גענומען, אונדזער דאַטן אילוסטרירן די אַרויסרופן פון עלוסידייטינג די קאָמפּלעקסיטי פון די מעקאַניזאַמז וואָס רעגולירן מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק. מיר ונטערשטרייַכן די נוציקייט פון TEM אין לערנען מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע ווי אַ מעסטאַבאַל קאָנווערדזשענט ענדפּוינט פון מיטאָזיס אין SH-SY5Y צעלן. אין דערצו, מיר ונטערשטרייַכן אַז TEM דאַטן צושטעלן די ריטשאַסט אינפֿאָרמאַציע ווען קאַמביינד מיט בילדגעבונג טעכניקן וואָס אויך כאַפּן דינאַמיש געשעענישן אין ענטפער צו מעטאַבאַליק דרוק. ווייטער קעראַקטעריזאַטיאָן פון די מאָלעקולאַר רעגולאַטאָרי מעקאַניזאַמז וואָס שטיצן נעוראָנאַל צעל מיטאָזיס קען צושטעלן וויכטיק ינסייט אין די מיטאָטשאָנדריאַל קאָמפּאָנענט פון נערוועז סיסטעם און נעוראָדעגענעראַטיוו חולאתן.
כדי צו אינדוצירן מיטאכאנדריעלן סטרעס, זענען SH-SY5Y צעלן באהאנדלט געווארן מיט PPA ניצנדיק 3 mM און 5 mM סאדיום פראפיאנאט (NaP). פאר TEM, זענען די מוסטערן אונטערגעווארפן געווארן צו קריאגענישע מוסטער צוגרייטונג ניצנדיק הויך-דרוק איינפרירן און איינפרירן (פיגור 1a). מיר האבן אנטוויקלט אן אויטאמאטישע מיטאכאנדריעל בילד אנאליז רערנ-ליניע צו מעסטן אכט מארפאלאגישע פאראמעטערס פון מיטאכאנדריעל פאפולאציעס איבער דריי ביאלאגישע רעפליקאטן. מיר האבן געפונען אז PPA באהאנדלונג האט באדייטנד געטוישט פיר פאראמעטערס: שטח 2, שטח, פערימעטער, און פערעט דיאמעטער (פיגור 1b-e). שטח 2 איז באדייטנד פארקלענערט געווארן מיט ביידע 3 mM און 5 mM PPA באהאנדלונג (p = 0.0183 און p = 0.002, בהתאמה) (פיגור 1b), בשעת שטח (p = 0.003), פערימעטער (p = 0.0106) און פערעט דיאמעטער האבן אלע באדייטנד פארקלענערט זיך. עס איז געווען א באדייטנדע רעדוקציע (p = 0.0172) אין דער 5 mM באהאנדלונג גרופע קאמפערד צו דער קאנטראל גרופע (פיגור 1c-e). באַדייטנדיקע רעדוקציעס אין שטח און אַרומנעם האָבן געוויזן אַז צעלן באַהאַנדלט מיט 5 mM PPA האָבן געהאַט קלענערע, מער קייַלעכדיקע מיטאָטשאָנדריאַ, און אַז די מיטאָטשאָנדריאַ זענען געווען ווייניקער פֿאַרלענגערט ווי די אין קאָנטראָל צעלן. דאָס איז אויך קאָנסיסטענט מיט אַ באַדייטנדיקע פֿאַרקלענערונג אין די Feret דיאַמעטער, אַן אומאָפּהענגיקער פּאַראַמעטער וואָס ווייַזט אַ פֿאַרקלענערונג אין דער גרעסטער דיסטאַנץ צווישן פּאַרטיקל עדזשאַז. ענדערונגען אין דער אולטראַסטרוקטור פון די קריסטאַע זענען באמערקט געוואָרן: די קריסטאַע איז געוואָרן ווייניקער אויסגעשפּראָכן אונטערן השפּעה פון PPA דרוק (פיגור 1a, פּאַנעל B). אָבער, נישט אַלע בילדער האָבן קלאָר אָפּגעשפּיגלט די אולטראַסטרוקטור פון די קריסטאַע, אַזוי אַ קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליז פון די ענדערונגען איז נישט דורכגעפירט געוואָרן. די TEM דאַטן קענען אָפּשפּיגלען דריי מעגלעכע סצענאַרן: (1) PPA פֿאַרשטאַרקט פֿיזשאַן אָדער אינהיביץ פֿוזשאַן, וואָס פֿאַראורזאַכט עקזיסטירנדיקע מיטאָטשאָנדריאַ צו פֿאַרקלענערן אין גרייס; (2) פֿאַרשטאַרקט ביאָגענעסיס שאַפֿט נייַע, קלענערע מיטאָטשאָנדריאַ אָדער (3) אינדוצירט ביידע מעכאַניזמען סיימאַלטייניאַסלי. כאָטש די באַדינגונגען קענען נישט אונטערשיידן ווערן דורך TEM, באַדייטנדיקע מאָרפאָלאָגישע ענדערונגען ווייַזן ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל כאָומיאָסטאַסיס און דינאַמיק אונטער PPA דרוק. מיר האָבן דערנאָך אויסגעפֿאָרשט נאָך פּאַראַמעטערס צו ווייטער כאַראַקטעריזירן די דינאַמיק און די פּאָטענציעלע מעכאַניזמען וואָס ליגן אונטער זיי.
פּראָפּיאָניק זויער (PPA) רעמאָדעלט מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע. (א) רעפּרעזענטאַטיווע טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי (TEM) בילדער וואָס ווייַזן אַז מיטאָטשאָנדריאַל גרייס פאַרקלענערט זיך און מיטאָטשאָנדריאַ ווערן קלענער און מער קייַלעכיק מיט ינקריסינג PPA באַהאַנדלונג; 0 mM (נישט באַהאַנדלט), 3 mM און 5 mM, ריספּעקטיוולי. רויטע פייַלן ווייַזן מיטאָטשאָנדריאַ. (ב-ע) SH-SY5Y סעלז באַהאַנדלט מיט PPA פֿאַר 24 שעה זענען צוגעגרייט פֿאַר TEM און די רעזולטאַטן זענען אַנאַלייזד ניצן Fiji/ImageJ. פיר פון די אַכט פּאַראַמעטערס האָבן געוויזן באַטייטיק דיפעראַנסיז צווישן קאָנטראָל (נישט באַהאַנדלט, 0 mM PPA) און באַהאַנדלט (3 mM און 5 mM PPA) סעלז. (ב) ראַיאָן 2, (ג) שטח, (ד) פּערימעטער, (ע) פערעט דיאַמעטער. איין-וועג אַנאַליסיס פון וואַריאַנס (קאָנטראָל קעגן באַהאַנדלונג) און דאַנעט ס קייפל פאַרגלייַך טעסט זענען געניצט צו באַשטימען באַטייטיק דיפעראַנסיז (p < 0.05). דאַטן פונקטן רעפּרעזענטירן די דורכשניטלעך מיטאָטשאָנדריאַל ווערט פֿאַר יעדער יחיד צעל, און טעות באַרס רעפּרעזענטירן די דורכשניטלעך ± SEM. דאַטן געוויזן רעפּרעזענטירן n = 3, לפּחות 24 סעלז פּער רעפּליקאַט; אַ גאַנץ פון 266 בילדער זענען אַנאַלייזד; * ווײַזט אָן p < 0.05, ** ווײַזט אָן p < 0.01.
כדי ווייטער צו כאראקטעריזירן ווי מיטאכאנדריעל דינאמיק רעאגירט צו PPA, האבן מיר געפארבט מיטאכאנדריע מיט טעטראמעטילראדאמין עטיל עסטער (TMRE) און גענוצט צייט-פארלאנג מיקראסקאפיע און MEL אנאליז צו לאקאליזירן און קוואַנטיפיצירן מיטאכאנדריע נאך 24 שעה ביי 3 און 5 mM PPA. באהאנדלונג פון פיישאן און פיוזשאן געשעענישן. (פיגור 2a). נאך MEL אנאליז, זענען מיטאכאנדריע ווייטער אנאליזירט געווארן צו קוואַנטיפיצירן די צאל מיטאכאנדריעל סטרוקטורן און זייער דורכשניטלעכן פארנעם. מיר האבן באמערקט א קליינע אבער באדייטנדע פארגרעסערונג אין דער צאל פיישאן געשעענישן וואס פאסירן ביי 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] קאמפערד צו פיישאן [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] און פיוזשאן [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] און פיוזשאן [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] געשעענישן זענען באדייטנד פארגרעסערט געווארן ביי 5 mM קאמפערד צו קאנטראל (פיגור 3b). די צאָל פון מיטאָטשאָנדריאַ איז באַדייטנד געוואַקסן ביי ביידע 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] און 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (פיגור 3c), בשעת דער דורכשניטלעכער וואָלומען פון יעדער מיטאָטשאָנדריאַל סטרוקטור איז געבליבן אומגעביטן (פיגור 3c). 3d). צוזאַמען גענומען, דאָס סאַגדזשעסט אַז רעמאָדעלינג פון מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק דינט ווי אַ קאָמפּענסאַטאָרישע רעאַקציע וואָס הצלחה האַלט די אָרנטלעכקייט פון די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ. די פאַרגרעסערונג אין דער צאָל פון פישאַן געשעענישן ביי 3 mM PPA סאַגדזשעסט אַז די פאַרגרעסערונג אין מיטאָטשאָנדריאַל צאָל איז טיילווייז רעכט צו מיטאָטשאָנדריאַל פישאַן, אָבער געגעבן אַז דער דורכשניטלעכער מיטאָטשאָנדריאַל וואָלומען בלייבט עסענטועל אומגעביטן, קען ביאָגענעסיס נישט אויסגעשלאָסן ווערן ווי אַן נאָך קאָמפּענסאַטאָרישע רעאַקציע. אָבער, די דאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט די קלענערע, קיילעכדיקע מיטאָטשאָנדריאַל סטרוקטורן באמערקט דורך TEM און אויך ווייַזן באַדייטנדיקע ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק ינדוסט דורך PPA.
פּראָפּיאָניק זויער (PPA) אינדוצירט דינאַמישע מיטאָטשאָנדריאַלע רעמאָדעלינג צו האַלטן נעץ אָרנטלעכקייט. SH-SY5Y צעלן זענען קאָלטיווירט געוואָרן, באַהאַנדלט מיט 3 און 5 mM PPA פֿאַר 24 שעה און געפֿאַרבט מיט TMRE און Hoechst 33342, נאכגעפאָלגט דורך MEL אַנאַליז. (א) רעפּרעזענטאַטיווע צייט-פאַרשפּעטיקונג מיקראָסקאָפּיע בילדער וואָס ווייַזן קאָליר און בינאַריזירטע מאַקסימום אינטענסיטעט פּראָיעקציעס אין צייט 2 (t2) פֿאַר יעדער באַדינגונג. אויסגעקליבענע געגנטן וואָס זענען אנגעוויזן אין יעדן בינאַרישן בילד זענען פֿאַרבעסערט און געוויזן אין 3D אין דריי פֿאַרשידענע צייט ראָמען (t1-t3) צו אילוסטרירן די דינאַמיק איבער צייט; פֿוזשאַן געשעענישן זענען כיילייטיד אין גרין; פֿיסשאַן געשעענישן זענען כיילייטיד אין גרין. געוויזן אין רויט. (ב) דורכשניטלעך נומער פון דינאַמישע געשעענישן פּער באַדינגונג. (ג) דורכשניטלעך נומער פון מיטאָטשאָנדריאַלע סטרוקטורן פּער צעל. (ד) דורכשניטלעך באַנד (µm3) פון יעדער מיטאָטשאָנדריאַל סטרוקטור פּער צעל. דאַטן געוויזן זענען רעפּרעזענטאַטיוו פון n = 15 צעלן פּער באַהאַנדלונג גרופּע. טעות באַרס געוויזן רעפּרעזענטירן דורכשניטלעך ± SEM, וואָג באַר = 10 μm, * p < 0.05.
פּראָפּיאָניק זויער (PPA) פאַראורזאַכט טראַנסקריפּציאָנעלע סאַפּרעשאַן פון גענעס פֿאַרבונדן מיט מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק. SH-SY5Y צעלן זענען באַהאַנדלט געוואָרן מיט 3 און 5 mM PPA פֿאַר 24 שעה. רעלאַטיווע גענע קוואַנטיפֿיקאַציע איז דורכגעפֿירט געוואָרן מיט RT-qPCR און נאָרמאַליזירט צו B2M. מיטאָטשאָנדריאַל ביאָגענעסיס גענעס (אַ) cMYC, (ב) TFAM, (ג) NRF1 און (ד) NFE2L2. מיטאָטשאָנדריאַל פוסיאָן און פֿיסשאַן גענעס (ע) STOML2, (ו) OPA1, (ז) MFN1, (ח) MFN2 און (י) DRP1. באַדייטנדיקע אונטערשיידן (p < 0.05) זענען געטעסט געוואָרן מיט איין-וועג ANOVA (קאָנטראָל קעגן באַהאַנדלונג) און דאַנעט'ס קייפל פֿאַרגלייַך טעסט: * ינדיקייץ p < 0.05, ** ינדיקייץ p < 0.01, און **** ינדיקייץ p < 0.0001. באַרס רעפּרעזענטירן דורכשניטלעך אויסדרוק ± SEM. די געוויזן דאַטן רעפּרעזענטירן n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), און n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן.
דאטן פון TEM און MEL אנאליזן צוזאמען ווייזן אז PPA ענדערט מיטאכאנדריעל מאָרפאָלאָגיע און דינאַמיק. אָבער, די בילדגעבונג טעקניקס געבן נישט קיין איינבליק אין די אונטערלייגנדיקע מעכאַניזמען וואָס טרייבן די פּראָצעסן. מיר האָבן דעריבער אויסגעפאָרשט די mRNA אויסדרוק פון נייַן שליסל רעגולאַטאָרן פון מיטאכאנדריעל דינאַמיק, ביאָגענעסיס און מיטאָזיס אין ענטפער צו PPA באַהאַנדלונג. מיר האָבן קוואַנטיפיצירט צעל מיעלאָמאַ אָנקאָגענע (cMYC), נוקלעאַר רעספּעראַטאָרי פאַקטאָר (NRF1), מיטאכאנדריעל טראַנסקריפּציע פאַקטאָר 1 (TFAM), NFE2-ווי טראַנסקריפּציע פאַקטאָר BZIP (NFE2L2), גאַסטרין-ווי פּראָטעין 2 (STOML2), אָפּטיש נערוו אַטראָפי 1 (OPA1), מיטאָפוסין 1 (MFN1), מיטאָפוסין 2 (MFN2) און דינאַמין-פֿאַרבונדענע פּראָטעין 1 (DRP1) נאָך 24 שעה פון באַהאַנדלונג מיט 3 mM און 5 mM PPA. מיר האָבן באַאָבאַכטעט 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 און p < 0.0001, ריספּעקטיוולי) און 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA באַהאַנדלונג. (פיגור 3a–c). די פאַרקלענערונג אין mRNA אויסדרוק איז געווען דאָזע-אָפּהענגיק: די אויסדרוק פון cMYC, NRF1 און TFAM איז פאַרקלענערט געוואָרן מיט 5.7, 2.6 און 1.9 מאָל ביי 3 mM, ריספּעקטיוולי, און מיט 11.2, 3 און 2.2 מאָל ביי 5 mM. אין קאַנטראַסט, די צענטראַלע רעדאָקס ביאָגענעסיס גען NFE2L2 איז נישט געביטן געוואָרן ביי קיין קאָנצענטראַציע פון ​​PPA, כאָטש אַ ענלעכע דאָזע-אָפּהענגיקע טענדענץ פון פאַרקלענערטע אויסדרוק איז באַאָבאַכטעט געוואָרן (פיגור 3d).
מיר האָבן אויך אויסגעפאָרשט די אויסדרוק פון קלאַסישע גענעס וואָס זענען פאַרבונדן אין דער רעגולאַציע פון ​​שפּאַלטונג און פיוזשאַן. מען גלויבט אַז STOML2 איז פאַרבונדן אין פיוזשאַן, מיטאָפאַגי און ביאָגענעסיס, און זיין אויסדרוק איז געווען באַדייטנד רידוסט (p < 0.0001) דורך 3 mM (2.4-פאַכיקע ענדערונג) און 5 mM (2.8-פאַכיקע ענדערונג) PPA (פיגור 1). 3ד). ענלעך, OPA1 פיוזשאַן גענע אויסדרוק איז געווען פאַרקלענערט ביי 3 mM (1.6-פאַכיקע ענדערונג) און 5 mM (1.9-פאַכיקע ענדערונג) PPA (p = 0.006 און p = 0.0024, ריספּעקטיוולי) (פיגור 3f). אָבער, מיר האָבן נישט געפֿונען באַדייטנדע אונטערשיידן אין דער אויסדרוק פון פיוזשאַן גענעס MFN1, MFN2 אָדער שפּאַלטונג גענע DRP1 אונטער 24-שעה PPA דרוק (פיגור 3ג-i). דערצו, האבן מיר געפונען אז די לעוועלס פון פיר פיוזשאַן און פישאַן פּראָטעאינען (OPA1, MFN1, MFN2 און DRP1) האבן זיך נישט געענדערט אונטער די זעלבע באדינגונגען (פיגור 4a-d). עס איז וויכטיג צו באַמערקן אז די דאַטן שפּיגלען איין פונקט אין צייט און מעגלעך נישט שפּיגלען ענדערונגען אין פּראָטעין אויסדרוק אדער טעטיקייט לעוועלס בעת די פריע סטאַדיעס פון PPA דרוק. אָבער, באַדייטנדיקע רעדוקציעס אין דער אויסדרוק פון cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, און OPA1 ווייַזן באַדייטנדיקע טראַנסקריפּשאַנאַל דיסרעגולאַטיאָן פון מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאָליזאַם, ביאָגענעסיס, און דינאַמיק. דערצו, די דאַטן אונטערשטרייַכן די נוציקייט פון בילדגעבונג טעקניקס צו דירעקט שטודירן ענד-שטאַט ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל פונקציע.
פיוזשאַן און פישאַן פאַקטאָר פּראָטעין לעוועלס האָבן זיך נישט געביטן נאָך פּראָפּיאָניק זויער (PPA) באַהאַנדלונג. SH-SY5Y צעלן זענען באַהאַנדלט געוואָרן מיט 3 און 5 mM PPA פֿאַר 24 שעה. פּראָטעין לעוועלס זענען קוואַנטיפיצירט געוואָרן דורך וועסטערן בלאָט אַנאַליז, און אויסדרוק לעוועלס זענען נאָרמאַליזירט געוואָרן צו גאַנץ פּראָטעין. דורכשניטלעך פּראָטעין אויסדרוק און רעפּרעזענטאַטיווע וועסטערן בלאָטס פון ציל און גאַנץ פּראָטעין ווערן געוויזן. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. באַרס רעפּרעזענטירן דורכשניטלעך ± SEM, און דאַטן געוויזן זענען רעפּרעזענטאַטיוו פון n = 3 ביאָלאָגישע רעפּליקאַטעס. קייפל פאַרגלייַכן (p < 0.05) זענען דורכגעפירט געוואָרן מיט איין-וועג אַנאַליז פון וואַריאַנס און דאַנעט'ס טעסט. דער אָריגינעלער געל און בלאָט ווערן געוויזן אין פיגור S1.
מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע איז פֿאַרבונדן מיט מולטיסיסטעם קראַנקייטן, פֿון מעטאַבאַלישע, קאַרדיאָווואַסקולערע און מוסקולערע קראַנקייטן ביז נעוראָלאָגישע קראַנקייטן1,10. פֿילע נעוראָדעגענעראַטיווע און נעוראָדעגענעראַטיווע קראַנקייטן זענען פֿאַרבונדן מיט מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע, וואָס אונטערשטרייכט די וויכטיקייט פֿון די אָרגאַנעלן איבערן גאַנצן לעבן פֿונעם מוח. די קראַנקייטן שליסן איין פּאַרקינסאָן'ס קראַנקייט, אַלצהיימער'ס קראַנקייט און ASD3,4,18. אָבער, צוטריט צו מוח געוועב צו שטודירן די קראַנקייטן איז שווער, ספּעציעל אויף דער מעכאַניסטישער מדרגה, וואָס מאַכט צעלולאַרע מאָדעל סיסטעמען אַ נייטיקע אַלטערנאַטיווע. אין דעם לערנען, נוצן מיר אַ צעלולאַרע מאָדעל סיסטעם מיט PPA-באַהאַנדלטע SH-SY5Y צעלן צו איבערחזרן די מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע באמערקט אין נעוראָנאַלע קראַנקייטן, ספּעציעל אַוטיזם ספּעקטרום דיסאָרדערס. ניצן דעם PPA מאָדעל צו שטודירן מיטאָטשאָנדריאַלע דינאַמיק אין נעוראָנען קען צושטעלן אַן איבערבליק איבער די עטיאָלאָגיע פֿון ASD.
מיר האָבן אויסגעפאָרשט די מעגלעכקייט פון ניצן TEM צו זען ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע. עס איז וויכטיק צו באַמערקן אַז TEM מוז ריכטיק גענוצט ווערן צו מאַקסאַמיזירן זיין עפעקטיווקייט. צוגרייטונג פון קריאָ-ספּעסאַמאַנז אַלאַוז בעסער פּרעזערוויישאַן פון נעוראָנאַל סטראַקטשערז דורך סיימאַלטייניאַסלי פיקסירן צעלולאַרע קאָמפּאָנענטן און רעדוצירן די פאָרמירונג פון אַרטיפאַקץ34. אין איינקלאַנג מיט דעם, מיר האָבן באמערקט אַז נעוראָן-ווי SH-SY5Y סעלז האָבן געהאַט גאַנץ סובסעלולאַרע אָרגאַנעלעס און פאַרלענגערטע מיטאָטשאָנדריאַ (פיגור 1אַ). דאָס כיילייץ די נוציקייט פון קריאָגעניק צוגרייטונג טעקניקס פֿאַר שטודירן מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע אין נעוראָנאַל צעל מאָדעלס. כאָטש קוואַנטיטאַטיווע מעסטונגען זענען קריטיש פֿאַר אָביעקטיוו אַנאַליסיס פון TEM דאַטן, עס איז נאָך קיין קאָנסענסוס אויף וואָס ספּעציפיש פּאַראַמעטערס זאָל געמאסטן ווערן צו באַשטעטיקן מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגישע ענדערונגען. באַזירט אויף אַ גרויס נומער פון שטודיעס וואָס האָבן קוואַנטיטאַטיוולי אויסגעפאָרשט מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע17,31,32, מיר האָבן דעוועלאָפּעד אַן אָטאַמאַטיד מיטאָטשאָנדריאַל בילד אַנאַליסיס פּייפּליין וואָס מעסט אַכט מאָרפאָלאָגישע פּאַראַמעטערס, נעמלעך: שטח, שטח2, אַספּעקט פאַרהעלטעניש, פּערימעטער, צירקולאַריטי, גראַד, פערעט דיאַמעטער. און קייַלעכיקנאַס.
צווישן זיי, האט PPA באַדייטנד פארקלענערט שטח 2, שטח, פּערימעטער, און פערעט דיאַמעטער (פיגור 1ב-ע). דאָס האָט געוויזן אַז מיטאָטשאָנדריאַ איז געוואָרן קלענער און מער קייַלעכיק, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט פריערדיקע שטודיעס וואָס ווייַזן אַ פאַרקלענערונג אין מיטאָטשאָנדריאַל שטח נאָך 72 שעה פון PPA30-ינדוסט מיטאָטשאָנדריאַל דרוק. די מאָרפאָלאָגישע פֿעיִקייטן קען אָנווייַזן מיטאָטשאָנדריאַל פיסיאָן, אַ נייטיק פּראָצעס צו סעקוועסטער דאַמידזשד קאַמפּאָונאַנץ פון די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ צו העכערן זייער דעגראַדאַציע דורך מיטאָפאַגי35,36,37. אויף די אנדערע האַנט, די פאַרקלענערונג אין דורכשניטלעך מיטאָטשאָנדריאַל גרייס קען זיין פֿאַרבונדן מיט געוואקסן ביאָגענעסיס, וואָס רעזולטאַטן אין די פאָרמירונג פון קליין נייסאַנט מיטאָטשאָנדריאַ. געוואקסן פיסיאָן אָדער ביאָגענעסיס רעפּרעזענטירט אַ קאָמפּענסאַטאָרי ענטפער צו טייַנען מיטאָזיס קעגן מיטאָטשאָנדריאַל דרוק. אָבער, פאַרקלענערט מיטאָטשאָנדריאַל וווּקס, ימפּערד פוסיאָן, אָדער אנדערע באדינגונגען קענען נישט זיין אויסגעשלאָסן.
כאָטש די הויך-רעזאָלוציע בילדער באשאפן דורך TEM דערלויבן די באַשטימונג פון מאָרפאָלאָגישע קעראַקטעריסטיקס אויף דער מדרגה פון יחיד מיטאָטשאָנדריאַ, פּראָדוצירט דעם אופֿן צוויי-דימענסיאָנאַלע סנאַפּשאַץ אין איין פונקט אין צייט. צו שטודירן דינאַמישע רעאַקציעס צו מעטאַבאַליק דרוק, האָבן מיר געפֿאַרבט מיטאָטשאָנדריאַ מיט TMRE און געניצט צייט-פאַרשפּעטיקונג מיקראָסקאָפּיע מיט MEL אַנאַליז, וואָס דערלויבט הויך-דורכפיר 3D וויזואַליזאַציע פון ​​ענדערונגען אין די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ איבער צייט 33,38. מיר האָבן באמערקט סאַטאַל אָבער באַטייטיק ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק אונטער PPA דרוק (פיגור 2). ביי 3 mM, די נומער פון פישאַן געשעענישן געוואקסן באַטייטיק, בשעת פיוזשאַן געשעענישן פארבליבן די זעלבע ווי אין די קאָנטראָל. א פאַרגרעסערונג אין די נומער פון ביידע פישאַן און פיוזשאַן געשעענישן איז באמערקט ביי 5 mM PPA, אָבער די ענדערונגען זענען געווען בעערעך פּראָפּאָרציאָנעל, וואָס סאַגדזשעסטיד אַז פישאַן און פיוזשאַן קינעטיק דערגרייכן יקוואַליבריאַם ביי העכער קאַנסאַנטריישאַנז (פיגור 2b). די דורכשניטלעך מיטאָטשאָנדריאַל באַנד איז פארבליבן אַנטשיינדזשד ביי ביידע 3 און 5 mM PPA, וואָס ינדיקייץ אַז די אָרנטלעכקייט פון די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ איז געווען פּרעזערווד (פיגור 2d). דאָס שפיגלט די פיייקייט פון דינאַמיש מיטאָטשאָנדריאַל נעטוואָרקס צו רעאַגירן צו מילד מעטאַבאַליק דרוק צו יפעקטיוולי טייַנען כאָומיאָסטאַסיס אָן פאַרשאַפן נעץ פראַגמענטאַטיאָן. ביי 3 mM PPA, איז די פארגרעסערונג אין פיסשאַן גענוג צו העלפן דעם איבערגאַנג צו א נייעם גלייכגעוויכט, אבער א טיפערע קינעטישע רעמאָדעלינג איז פארלאנגט אין ענטפער צו סטרעס וואס ווערט געפֿירט דורך העכערע קאָנצענטראַציעס פון PPA.
די צאָל מיטאָטשאָנדריאַ איז געוואַקסן ביי ביידע PPA דרוק קאָנצענטראַציעס, אָבער דער דורכשניטלעכער מיטאָטשאָנדריאַלער באַנד האָט זיך נישט באַדייטנד געביטן (פיגור 2c). דאָס קען זיין צוליב געוואקסענער ביאָגענעסיס אָדער געוואקסענער טיילונג; אָבער, אין דער אָפּוועזנהייט פון אַ באַדייטנדיקער פאַרקלענערונג אין דורכשניטלעכן מיטאָטשאָנדריאַלן באַנד, איז עס מער מסתּמא אַז ביאָסינטעז וואַקסט. אָבער, די דאַטן אין פיגור 2 שטיצן די עקזיסטענץ פון צוויי קאָמפּענסאַטאָרישע מעכאַניזמען: אַ פאַרגרעסערונג אין דער צאָל פון שפּאַלטונג געשעענישן, קאָנסיסטענט מיט אַפּרעגולאַציע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַלער שפּאַלטונג, און אַ פאַרגרעסערונג אין דער צאָל געשעענישן, קאָנסיסטענט מיט מיטאָטשאָנדריאַלער ביאָגענעסיס. לעסאָף, דינאַמישע קאָמפּענסאַציע פֿאַר מילדן דרוק קען באַשטיין פון סיימאַלטייניאַס פּראַסעסאַז וואָס אַרייַנציען שפּאַלטונג, פיוזשאַן, ביאָגענעסיס און מיטאָפאַגי. כאָטש פריערדיקע מחברים האָבן געוויזן אַז PPA פֿאַרשטאַרקט מיטאָזיס30,39 און מיטאָפאַגי29, מיר צושטעלן באַווייַזן פֿאַר רעמאָדעלינג פון מיטאָטשאָנדריאַלער שפּאַלטונג און פיוזשאַן דינאַמיק אין ענטפער צו PPA. די דאַטן באַשטעטיקן די מאָרפאָלאָגישע ענדערונגען באמערקט דורך TEM און צושטעלן ווייטערדיקע ינסייט אין די מעכאַניזמען פֿאַרבונדן מיט PPA-ינדוסט מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע.
ווייל ניט TEM און ניט MEL אנאליז האבן געגעבן דירעקטע באווייזן פון די גענע רעגולאציע מעכאניזמען וואס ליגן אונטער די באמערקטע מארפאלאגישע ענדערונגען, האבן מיר אויסגעפארשט די RNA אויסדרוק פון גענעס וואס זענען פארמישט אין מיטאכאנדריעל מעטאבאליזם, ביאגענעסיס, און דינאמיק. די cMYC פראטא-אנקאגענע איז א טראנסקריפציע פאקטאר וואס איז פארמישט אין די רעגולאציע פון ​​מיטאכאנדריע, גליקאליז, אמינא זויער און פעטי זויער מעטאבאליזם40. דערצו, איז cMYC באקאנט צו רעגולירן די אויסדרוק פון כמעט 600 מיטאכאנדריעל גענעס וואס זענען פארמישט אין מיטאכאנדריעל טראנסקריפציע, איבערזעצונג, און קאמפלעקסע אסעמבלי, אריינגערעכנט NRF1 און TFAM41. NRF1 און TFAM זענען צוויי צענטראלע רעגולאטארן פון מיטאזיס, וואס ארבעטן נאך PGC-1α צו אקטיוויזירן mtDNA רעפליקאציע. דער וועג ווערט אקטיוויזירט דורך cAMP און AMPK סיגנאלינג און איז סענסיטיוו צו ענערגיע אויסגאבן און מעטאבאלישן סטרעס. מיר האבן אויך אויסגעפארשט NFE2L2, א רעדאקס רעגולאטאר פון מיטאכאנדריעל ביאגענעסיס, צו באשטימען צי די עפעקטן פון PPA זענען אפשר מעדיאטירט דורך אקסידאטיוון סטרעס.
כאָטש NFE2L2 אויסדרוק איז געבליבן אַנטשיינדזשד, האָבן מיר געפֿונען אַ קאָנסיסטענט דאָזע-אָפּהענגיק פאַרקלענערונג אין דער אויסדרוק פון cMYC, NRF1 און TFAM נאָך 24 שעה פון באַהאַנדלונג מיט 3 mM און 5 mM PPA (פיגור 3a-c). דאַונרעגולאַציע פון ​​cMYC אויסדרוק איז פריער געמאלדן געוואָרן ווי אַ ענטפער צו מיטאָטשאָנדריאַל דרוק42, און פאַרקערט, דאַונרעגולאַציע פון ​​cMYC אויסדרוק קען פאַרשאַפן מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע דורך רימאָדעלינג מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאָליזאַם, נעץ קאַנעקטיוויטי, און מעמבראַן פּאָלאַריזאַציע43. אינטערעסאַנט, cMYC איז אויך ינוואַלווד אין די רעגולאַציע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַל פישאַן און פוסיאָן42,43 און איז באַוווסט צו פאַרגרעסערן DRP1 פאָספאָרילאַטיאָן און מיטאָטשאָנדריאַל לאָקאַליזאַטיאָן בעשאַס צעל דיוויזשאַן44, ווי געזונט ווי מעדיאַטינג מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאַלאַדזשיקאַל רימאָדעלינג אין נעוראָנאַל סטעם סעלז45. טאַקע, cMYC-דעפישיענט פיבראָבלאַסטן ווייַזן רידוסט מיטאָטשאָנדריאַל גרייס, קאָנסיסטענט מיט ענדערונגען ינדוסט דורך PPA43 דרוק. די דאַטן אילוסטרירן אַן אינטערעסאַנט אָבער נאָך נישט קלאָר שייכות צווישן cMYC און מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק, פּראַוויידינג אַן אינטערעסאַנט ציל פֿאַר צוקונפֿט שטודיעס פון PPA דרוק-ינדוסט רימאָדעלינג.
די רעדוקציע פון ​​NRF1 און TFAM איז קאָנסיסטענט מיט דער ראָלע פון ​​cMYC ווי אַ וויכטיקער טראַנסקריפּציאָנעלער אַקטיוואַטאָר. די דאַטן זענען אויך קאָנסיסטענט מיט פריערדיקע שטודיעס אין מענטשלעכע קאָלאָן ראַק צעלן וואָס ווייַזן אַז PPA האָט רעדוצירט NRF1 mRNA אויסדרוק ביי 22 שעה, וואָס איז געווען פֿאַרבונדן מיט ATP דיפּלישאַן און געוואקסן ROS46. די מחברים האָבן אויך געמאלדן אַז TFAM אויסדרוק איז געוואקסן ביי 8.5 שעה אָבער איז צוריקגעקומען צו באַזעלינע לעוועלס ביי 22 שעה. אין קאַנטראַסט, קים et al. (2019) האָבן געוויזן אַז TFAM mRNA אויסדרוק איז געווען באַדייטנד דיקריסט נאָך 4 שעה פון PPA דרוק אין SH-SY5Y צעלן; אָבער, נאָך 72 שעה, TFAM פּראָטעין אויסדרוק איז געווען באַדייטנד געוואקסן און mtDNA קאָפּיע נומער איז געווען באַדייטנד געוואקסן. אזוי, די פאַרקלענערן אין דער נומער פון מיטאָטשאָנדריאַל ביאָגענעסיס גענעס וואָס מיר האָבן באמערקט נאָך 24 שעה טוט נישט ויסשליסן די מעגלעכקייט אַז די פאַרגרעסערן אין דער נומער פון מיטאָטשאָנדריאַ איז פֿאַרבונדן מיט אַקטיווירונג פון ביאָגענעסיס אין פריערדיקע צייט פונקטן. פריערדיגע שטודיעס האבן געוויזן אז PPA פארגרעסערט באדייטנד PGC-1α mRNA און פראטעין אין SH-SY5Y צעלן ביי 4 שעה 30 מינוט, בשעת פראפיאנישע זויער פארשטארקט מיטאכאנדריעל ביאגענעסיס אין קאלב העפּאַטאָסיטעס דורך PGC-1α ביי 12 שעה 39 מינוט. אינטערעסאנט, PGC-1α איז נישט נאר א דירעקטער טראַנסקריפּציאָנעלער רעגולאַטאָר פון NRF1 און TFAM, נאר עס איז אויך געוויזן געווארן צו רעגולירן די טעטיקייט פון MFN2 און DRP1 דורך רעגולירן פישאַן און פיוזשאַן47. צוזאמען גענומען, דאס אונטערשטרייכט די נאנטע פארבינדונג פון מעקאַניזמען וואס רעגולירן מיטאכאנדריעל קאמפּענסאַטאָרישע רעאַקציעס וואס ווערן אינדוצירט דורך PPA. דערצו, אונדזערע דאַטן שפיגלען אפ באדייטנדע דיסרעגולאַציע פון ​​טראַנסקריפּציאָנעלער רעגולאַציע פון ​​ביאגענעסיס און מעטאַבאָליזם אונטער PPA דרוק.
די STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 און DRP1 גענעס זענען צווישן די צענטראלע רעגולאַטאָרן פון מיטאָטשאָנדריאַל פישאַן, פוסיאָן און דינאַמיק37,48,49. עס זענען פילע אנדערע גענעס ינוואַלווד אין מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק, אָבער, STOML2, OPA1 און MFN2 זענען פריער געפֿונען צו זיין דיפערענטשאַלי מעטילייטיד אין ASD קאָהאָרטס,16 און עטלעכע אומאָפּהענגיקע שטודיעס האָבן געמאלדן ענדערונגען אין די טראַנסקריפּציע פאַקטאָרן אין ענטפער צו מיטאָטשאָנדריאַל דרוק50,51.52. די אויסדרוק פון ביידע OPA1 און STOML2 איז געווען באַטייטיק רידוסט דורך 3 mM און 5 mM PPA באַהאַנדלונג (פיגור 3e, f). OPA1 איז איינער פון די קלאַסישע רעגולאַטאָרן פון מיטאָטשאָנדריאַל פוסיאָן דורך דירעקט ינטעראַקשאַן מיט MFN1 און 2 און שפּילט אַ ראָלע אין קריסטאַע רימאָדעלינג און מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגי53. די פּינטלעך ראָלע פון ​​STOML2 אין מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק בלייבט ומקלאָר, אָבער עווידענס סאַגדזשעסץ אַז עס שפּילט אַ ראָלע אין מיטאָטשאָנדריאַל פוסיאָן, ביאָגענעסיס און מיטאָפאַגי.
STOML2 איז פארמישט אין אויפהאלטן מיטאכאנדריעל רעספּיראַטאָרישע קאַפּלינג און פאָרמירונג פון רעספּיראַטאָרישע קייט קאָמפּלעקסן54,55 און עס איז געוויזן געוואָרן אַז עס ענדערט טיף די מעטאַבאַלישע קעראַקטעריסטיקס פון ראַק צעלן56. שטודיעס האָבן געוויזן אַז STOML2 פּראָמאָטירט מיטאכאנדריעל מעמבראַן פּאָטענציעל און ביאָגענעסיס דורך ינטעראַקשאַן מיט BAN און קאַרדיאָליפּין 55, 57, 58. דערצו, אומאָפּהענגיקע שטודיעס האָבן געוויזן אַז די ינטעראַקשאַן צווישן STOML2 און PINK1 רעגולירט מיטאָפאַגי59,60. באַמערקענסווערט, STOML2 איז געמאלדן געוואָרן צו דירעקט ינטעראַקט מיט און סטאַביליזירן MFN2 און אויך שפּילט אַ וויכטיקע ראָלע אין סטאַביליזירן לאַנגע OPA1 יסאָפאָרמז דורך ינכיבאַטינג די פּראָטעאַסע פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר OPA1 דעגראַדאַציע53,61,62. די רעדוקציע אין STOML2 אויסדרוק באמערקט אין PPA ריאַקשאַנז קען מאַכן די פיוזשאַן פּראָטעינס מער סאַסעפּטאַבאַל צו דעגראַדאַציע דורך יוביקוויטין- און פּראָטעאַסאָמע-אָפענגיק פּאַטווייז48. כאָטש די פּינקטלעכע ראָלע פֿון STOML2 און OPA1 אין דער דינאַמישער רעאַקציע צו PPA איז נישט קלאָר, קען אַ פֿאַרמינדערטע אויסדרוק פֿון די פֿוזשאַן גענעס (פֿיגור 3) שטערן דעם באַלאַנס צווישן פֿאַלציע און פֿוזשאַן און פֿירן צו אַ פֿאַרמינדערטער מיטאָטשאָנדריאַלער גרייס (פֿיגור 3).1).
אויף דער אנדערער האַנט, איז די OPA1 פּראָטעין אויסדרוק געבליבן אומגעביטן נאָך 24 שעה, בשעת די mRNA און פּראָטעין לעוועלס פון MFN1, MFN2 אדער DRP1 האבן זיך נישט באדייטנד געביטן נאך PPA באַהאַנדלונג (פיגור 3g-i, פיגור 4). דאָס קען אָנווייַזן אַז עס זענען נישטאָ קיין ענדערונגען אין דער רעגולאַציע פון ​​די פאַקטאָרן וואָס זענען ינוואַלווד אין מיטאָטשאָנדריאַל פוסיאָן און פישאַן. אָבער, עס איז ווערט צו באַמערקן אַז יעדער פון די פיר גענעס איז אויך רעגולירט דורך פּאָסטטראַנסקריפּשאַנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס (PTMs) וואָס קאָנטראָלירן פּראָטעין טעטיקייט. OPA1 האט אַכט אַלטערנאַטיווע ספּלייס וועריאַנטן וואָס זענען פּראָטעאָליטיש שפּאַלטן אין מיטאָטשאָנדריאַ צו פּראָדוצירן צוויי באַזונדערע יסאָפאָרמז 63. די וואָג צווישן לאַנגע און קורצע יסאָפאָרמז באַשטימט לעסאָף די ראָלע פון ​​OPA1 אין מיטאָטשאָנדריאַל פוסיאָן און וישאַלט פון די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ 64. DRP1 טעטיקייט איז רעגולירט דורך קאַלסיום/קאַלמאָדולין-אָפּהענגיק פּראָטעין קינאַזע II (CaMKII) פאָספאָרילאַטיאָן, בשעת DRP1 דעגראַדאַציע איז רעגולירט דורך יוביקוויטינאַטיאָן און SUMOylation65. צום סוף, ביידע DRP1 און MFN1/2 זענען GTPases, אַזוי אַקטיוויטעט קען זיין באַאיינפלוסט דורך די קורס פון GTP פּראָדוקציע אין מיטאָטשאָנדריאַ 66. דעריבער, כאָטש די אויסדרוק פון די פּראָטעאינען בלייבט קאָנסטאַנט, דאָס קען נישט שפּיגלען די אַנטשיינדזשד פּראָטעין אַקטיוויטעט אָדער לאָקאַליזאַציע 67,68. טאַקע, עקזיסטירנדיקע PTM פּראָטעין רעפּערטואַרן דינען אָפט ווי די ערשטע ליניע פון ​​​​פאַרטיידיקונג פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר מעדיאַטינג אַקוטע דרוק רעספּאָנסעס. אין דער בייַזייַן פון מיטלמעסיק מעטאַבאַליק דרוק אין אונדזער מאָדעל, איז עס מסתּמא אַז PTM פּראַמאָוץ געוואקסן אַקטיוויטעט פון פיוזשאַן און פישאַן פּראָטעאינען צו גענוג ומקערן מיטאָטשאָנדריאַל אָרנטלעכקייט אָן ריקוויירינג נאָך אַקטיוואַציע פון ​​​​די גענעס אין די mRNA אָדער פּראָטעין מדרגה.
צוזאַמען גענומען, די אויבנדערמאָנטע דאַטן אונטערשטרייַכן די קאָמפּלעקסע און צייט-אָפּהענגיקע רעגולאַציע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע און די טשאַלאַנדזשיז פון עלוידייזינג די מעханіזמען. צו שטודירן גען אויסדרוק, איז עס ערשט נייטיק צו ידענטיפיצירן ספּעציפֿישע ציל גענעס אין דעם וועג. אָבער, אונדזערע דאַטן ווייַזן אַז גענעס אין דעם זעלבן וועג רעאַגירן נישט אין דער זעלביקער וועג צו דער זעלביקער דרוק. אין פאַקט, פריערדיקע שטודיעס האָבן געוויזן אַז פאַרשידענע גענעס אין דעם זעלבן וועג קען ווייַזן פאַרשידענע טעמפּאָראַל ענטפער פּראָופיילז30,46. אין דערצו, עס זענען קאָמפּלעקס פּאָסט-טראַנסקריפּשאַנאַל מעханіזמען וואָס צעשטערן די שייכות צווישן טראַנסקריפּציע און גען פונקציע. פּראָטעאָמיק שטודיעס קענען צושטעלן ינסייט אין די פּראַל פון PTMs און פּראָטעין פונקציע, אָבער זיי אויך שטעלן טשאַלאַנדזשיז אַרייַנגערעכנט נידעריק-דורכפיר מעטאָדן, הויך סיגנאַל-צו-ראַש פאַרהעלטענישן, און נעבעך האַכלאָטע.
אין דעם קאנטעקסט, שטודירן מיטאכאנדריעל מאָרפאָלאָגיע ניצן TEM און MEL האט גרויס פּאָטענציאַל צו אַדרעסירן פונדאַמענטאַלע פֿראַגן וועגן די שייכות צווישן מיטאכאנדריעל דינאַמיק און פֿונקציע און ווי דאָס השפּעה אויף קראַנקייט. וויכטיקסטנס, TEM גיט אַ דירעקט מעטאָד פֿאַר מעסטן מיטאכאנדריעל מאָרפאָלאָגיע ווי אַ קאָנווערדזשענט ענדפּוינט פון מיטאכאנדריעל דיספֿונקציע און דינאַמיק 51. MEL אויך גיט אַ דירעקט מעטאָד פֿאַר וויזשוואַלייזינג פישאַן און פוסיאָן געשעענישן אין אַ דריי-דימענשאַנאַל צעלולאַרע סביבה, אַלאַוינג קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​דינאַמיש מיטאכאנדריעל רעמאָדעלינג אפילו אין דער אַוועק פון ענדערונגען אין דזשין אויסדרוק 33. דאָ מיר הויכפּונקט די נוציקייט פון מיטאכאנדריעל בילדגעבונג טעקניקס אין צווייטיק מיטאכאנדריעל קראַנקייטן. די קראַנקייטן זענען טיפּיקלי קעראַקטערייזד דורך כראָניש מילד מעטאַבאַליק דרוק קעראַקטערייזד דורך סאַטאַל רימאָדעלינג פון מיטאכאנדריעל נעטוואָרקס אלא ווי אַקוטע מיטאכאנדריעל שעדיקן. אָבער, די מיטאכאנדריעל קאָמפּענסאַציע פארלאנגט צו טייַנען מיטאָזיס אונטער כראָניש דרוק האט טיף פאַנגקשאַנאַל קאַנסאַקווענסאַז. אין דעם קאנטעקסט פון נעוראָוויסנשאַפט, אַ בעסער פארשטאנד פון די קאָמפּענסאַטאָרי מעקאַניזאַמז קען צושטעלן וויכטיק אינפֿאָרמאַציע וועגן די פּלעיאָטראָפּיק נעוראָפּאַטאַלאַדזשי פארבונדן מיט מיטאכאנדריעל דיספֿונקציע.
לעסאָף, אונדזער דאַטן אונטערשטרייַכן די נוצלעכקייט פון בילדגעבונג טעקניקס פֿאַר פֿאַרשטיין די פאַנגקשאַנאַל קאַנסאַקווענסאַז פון די קאָמפּלעקס ינטעראַקשאַנז צווישן גען אויסדרוק, פּראָטעין מאָדיפיקאַטיאָנס, און פּראָטעין טעטיקייט וואָס קאָנטראָלירן נעוראָנאַל מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק. מיר האָבן געניצט PPA צו מאָדעל מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע אין אַ נעוראָנאַל צעל מאָדעל צו באַקומען ינסייט אין די מיטאָטשאָנדריאַל קאָמפּאָנענט פון ASD. SH-SY5Y סעלז באהאנדלט מיט PPA האָבן געוויזן ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגי: מיטאָטשאָנדריאַ זענען געוואָרן קליין און קיילעכדיק, און קריסטאַע זענען געווען שוואַך דעפינירט ווען באמערקט דורך TEM. MEL אַנאַליסיס ווייזט אַז די ענדערונגען פּאַסירן גלייַכצייַטיק מיט אַ פאַרגרעסערונג אין פישאַן און פוסיאָן געשעענישן צו טייַנען די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ אין ענטפער צו מילד מעטאַבאַליק דרוק. דערצו, PPA באַדייטנד דיסראַפּשאָנאַל רעגולאַטיאָן פון מיטאָטשאָנדריאַל מעטאַבאָליזאַם און כאָומיאָסטאַסיס. מיר האָבן יידענטאַפייד cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, און OPA1 ווי שליסל מיטאָטשאָנדריאַל רעגולאַטאָרס דיסראַפּטיד דורך PPA דרוק און קען שפּילן אַ ראָלע אין מעדיאַטינג PPA-ינדוסט ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגי און פונקציע. צוקונפֿט שטודיעס זענען דארף צו בעסער כאַראַקטערייז PPA-ינדוסט טעמפּאָראַל ענדערונגען אין גען אויסדרוק און פּראָטעין טעטיקייט, לאָקאַליזאַטיאָן, און פּאָסט-טראַנסלאַציאָנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס. אונדזערע דאַטן אונטערשטרייַכן די קאָמפּלעקסיטעט און אינטערדעפּענדענס פון די רעגולאַטאָרישע מעханіזמען וואָס מעדיאַטירן די מיטאָטשאָנדריאַל דרוק רעאַקציע און ווייַזן די נוציקייט פון TEM און אנדערע בילדגעבונג טעקניקס פֿאַר מער טאַרגעטעד מעכאַניסטישע שטודיעס.
די SH-SY5Y צעל ליניע (ECACC, 94030304-1VL) איז געקויפט געוואָרן פֿון Sigma-Aldrich. SH-SY5Y צעלן זענען געוואַקסן געוואָרן אין Dulbecco's מאָדיפֿיצירטן Eagle's מעדיום/F-12 נוטריאַנט געמיש (DMEM/F-12) און L-גלוטאַמין (SC09411, ScienCell) אין 25 קוביק סענטימעטער פֿלעשלעך סופּלעמענטירט מיט 20% פֿעטאַלן רינדער סערום (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) און 1% פּעניסיללין-סטרעפּטאָמיצין (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ביי 37 °C, 5% CO2. צעלן זענען סובקולטורירט געוואָרן צו 80% קאָנפֿלוענס ניצנדיק 0.05% טריפּסין-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), סענטריפוגירט ביי 300 ג און פּלאַטירט ביי אַ געדיכטקייט פֿון אַפּראָקסימאַטלי 7 × 105 צעלן/מל. אלע עקספערימענטן זענען דורכגעפירט געווארן אויף אומדיפערענצירטע SH-SY5Y צעלן צווישן פאסאזשן 19-22. PPA ווערט אדמיניסטרירט אלס NaP. צעלאָזט NaP פּודער (CAS נומ. 137-40-6, כעמישע פאָרמולע C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) אין וואַרעם MilliQ וואַסער צו אַ קאָנצענטראַציע פון ​​1 M און לאַגערט ביי 4 °C. אום טאָג פון באַהאַנדלונג, פארדיןנט די לייזונג מיט 1 M PPA צו 3 mM און 5 mM PPA אין סערום-פֿרייער מעדיום (DMEM/F-12 מיט L-גלוטאַמין). באַהאַנדלונג קאָנצענטראַציעס פֿאַר אַלע עקספּערימענטן זענען געווען קיין PPA (0 mM, קאָנטראָל), 3 mM, און 5 mM PPA. עקספּערימענטן זענען דורכגעפירט געווארן אין לפּחות דריי ביאָלאָגישע רעפּליקאַטן.
SH-SY5Y צעלן זענען געזייט געווארן אין 25 קוביק סענטימעטער פלעשער מיט א ראטע פון ​​5.5 × 105 צעלן/מל און געוואקסן פאר 24 שעה. די PPA באהאנדלונג איז צוגעגעבן געווארן צום פלעשער פאר 24 שעה פון אינקובאציע. זאמלט צעל פּעלעטס נאכפאלגנדיג נארמאלע זויגער געוועב סובקולטור פראטאקאלן (באשריבן אויבן). איבערסוספּענדירט די צעל פּעלעט אין 100 µl 2.5% גלוטאַראַלדעהייד, 1× PBS און האלט ביי 4 °C ביז פראצעסירונג. SH-SY5Y צעלן זענען קורץ סענטריפוגירט געווארן צו פּעלעטירן די צעלן און ארויסנעמען 2.5% גלוטאַראַלדעהייד, 1× PBS לייזונג. איבערסוספּענדירט די סעדימענט אין א 4% אַגאַראָזע געל צוגעגרייט אין דיסטילירט וואַסער (די פאַרהעלטעניש פון אַגאַראָזע צו סעדימענט באַנד איז 1:1). אַגאַראָזע שטיקלעך זענען געשטעלט געווארן אויף גרידס אויף פלאַכע פּלאַטעס און באדעקט מיט 1-העקסאַדעסען פאר הויך-דרוק איינפרירן. מוסטערן זענען איינגעפראָרן געווארן אין 100% טרוקן אַצעטאָן ביי -90°C פאר 24 שעה. די טעמפּעראַטור איז דעמאָלט געהויבן געוואָרן צו -80°C און אַ לייזונג פון 1% אָסמיום טעטראָקסייד און 0.1% גלוטאַראַלדעהייד איז צוגעגעבן געוואָרן. די מוסטערן זענען געהאַלטן געוואָרן ביי -80°C פֿאַר 24 שעה. נאָכדעם איז די טעמפּעראַטור ביסלעכווייַז געהויבן געוואָרן צו צימער טעמפּעראַטור איבער עטלעכע טעג: פון –80°C ביז –50°C פֿאַר 24 שעה, ביז –30°C פֿאַר 24 שעה, ביז –10°C פֿאַר 24 שעה און צום סוף צו צימער טעמפּעראַטור.
נאך קריאגענישער צוגרייטונג, זענען די מוסטערן אימפרעגנירט געווארן מיט רעזין און אולטרא-דינע סעקשאַנז (∼100 נאַנאָמעטער) זענען געמאכט געווארן מיט א Leica Reichert UltracutS אולטראמיקראָטאָם (Leica Microsystems). סעקשאַנז זענען געפארבט געווארן מיט 2% אוראַניל אַצעטאַט און בליי ציטראַט. מוסטערן זענען באַאָבאַכטעט געווארן מיט א FEI Tecnai 20 טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּ (ThermoFisher (פריער FEI), איינדהאָווען, די נעטהערלאַנדס) וואָס אַרבעט ביי 200 קילוואָלט (Lab6 טראַנסמיטער) און א Gatan CCD קאַמעראַ (Gatan, UK) אויסגעשטאַט מיט א Tridiem ענערגיע פילטער.
אין יעדן טעכנישן רעפּליקאַט, זענען לפּחות 24 איינצל-צעל בילדער געכאפט געוואָרן, פֿאַר אַ סך הכל פון 266 בילדער. אַלע בילדער זענען אַנאַליזירט געוואָרן מיטן "רעגיאָן פון אינטערעס" (ROI) מאַקראָ און מיטן "מיטאָטשאָנדריאַ" מאַקראָ. דער מיטאָטשאָנדריאַל מאַקראָ איז באַזירט אויף פאַרעפֿנטלעכטע מעטאָדן17,31,32 און דערמעגלעכט האַלב-אָטאָמאַטישע באַטש פּראַסעסינג פון TEM בילדער אין פֿידזשי/ImageJ69. אין קורצן: דער בילד ווערט איבערגעדרייט און איבערגעדרייט מיטן נוצן "ראָולינג באָל" הינטערגרונט סובטראַקציע (60 פּיקסעל ראַדיוס) און אַן FFT באַנדפּאַס פֿילטער (מיט 60 און 8 פּיקסעל אויבערשטע און אונטערשטע גרענעצן ריספּעקטיוולי) און ווערטיקאַלע ליניע סאַפּרעשאַן מיט אַן אָריענטאַציע טאָלעראַנץ פון 5%. דער פּראַסעסט בילד ווערט אויטאָמאַטיש טרעשאָולדעד מיטן נוצן אַ מאַקסימום ענטראָפּיע אַלגערידאַם און אַ בינאַרע מאַסקע ווערט דזשענערירט. בילד געגנטן פֿאַרבונדן מיט מאַנועל אויסגעקליבענע ROIs אין רויע TEM בילדער זענען עקסטראַקטירט געוואָרן, כאַראַקטעריזירנדיק מיטאָטשאָנדריאַ און אויסשליסנדיק די פּלאַזמע מעמבראַנע און אַנדערע הויך-קאָנטראַסט געגנטן. פאר יעדן עקסטראקטירטן ROI, זענען בינארישע פארטיקלען גרעסער ווי 600 פיקסעלן אנאליזירט געווארן, און פארטיקל שטח, פערימעטער, גרויסע און קליינע אקסן, פערעט דיאמעטער, קיילעכדיקייט, און צירקולאריטעט זענען געמאסטן געווארן מיט די איינגעבויטע מעסטונג פונקציעס פון פידזשי/אימעדזשעי. נאכפאלגנדיג מעריל, פליפא, און סטראק (2017), זענען שטח 2, פארטיקל אספעקט פראפארציע (גרויסע צו קליינע אקס פראפארציע), און פארעם פאקטאר (FF) אויסגערעכנט געווארן פון די דאטן, וואו FF = פערימעטער 2/4פי x שטח. די דעפיניציע פון ​​דער פאראמעטרישער פארמולע קען געפונען ווערן אין מעריל, פליפא, און סטראק (2017). די דערמאנטע מאקראס זענען פאראן אויף גיטהאב (זעה דאטן פאראן סטעיטמענט). אין דורכשניט, זענען בערך 5,600 פארטיקלען אנאליזירט געווארן פער PPA באהאנדלונג, פאר א סך הכל פון בערך 17,000 פארטיקלען (דאטן נישט געוויזן).
SH-SH5Y צעלן זענען געשטעלט געוואָרן אין 8-קאַמער קולטור שיסלען (ThermoFisher, #155411) צו דערלויבן אַדכיזשאַן איבער נאַכט און דערנאָך אינקובירט מיט TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) און Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). פאַרבן. בילדער זענען באַקומען מיט 405 נם און 561 נם לאַזערס איבער אַ 10 מינוט סביבה, און רויע בילדער זענען באַקומען ווי z-סטאַקס מיט 10 בילד מיקראָגראַפס מיט אַ az שריט פון 0.2 μm צווישן בילד ראָמען ביי 12 סאַבסאַקוואַנט צייט פונקטן. בילדער זענען געזאַמלט מיט אַ Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 סופּער-רעזאָלוציע פּלאַטפאָרמע (Carl Zeiss, Oberkochen, דייטשלאנד) מיט אַ LCI פּלאַן אַפּאָכראָמאַטע 100x/1.4 אויל DIC M27 לענס. בילדער זענען אנאליזירט געווארן אין ImageJ ניצנדיק א פריער באשריבענע פּייפּליין און דעם ImageJ פּלוגין צו מעסטן פיוזשאַן און פישאַן געשעענישן, דורכשניטלעכע צאָל פון מיטאָטשאָנדריאַל סטרוקטורן, און דורכשניטלעכע מיטאָטשאָנדריאַל באַנד פּער צעל33. MEL מאַקראָס זענען בנימצא אויף GitHub (זען דאַטן אַוויילאַביליטי סטעיטמענט).
SH-SY5Y צעלן זענען געוואקסן אין זעקס-ברונע פּלאַטעס מיט אַ געדיכטקייט פון 0.3 × 106 צעלן/מל פֿאַר 24 שעה איידער באַהאַנדלונג. RNA איז עקסטראַקטעד ניצן די Quick-RNA™ Miniprep פּראָטאָקאָל (ZR R1055, Zymo Research) מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס: לייג 300 μl פון RNA ליזיס באַפער צו יעדן ברונעם איידער אַרויסנעמען און ליז יעדן מוסטער ווי אַ לעצטער שריט מיט 30 μl פון DNase/RNase עלוטיאָן-פֿרייַ וואַסער. אַלע מוסטערן זענען געטשעקט פֿאַר קוואַנטיטי און קוואַליטעט ניצן אַ NanoDrop ND-1000 UV-Vis ספּעקטראָפאָטאָמעטער. גאַנץ פּראָטעין פון צעל ליזאַטן איז באקומען ניצן 200 μl RIPA ליזיס באַפער, און פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן איז קוואַנטיפיצירט ניצן די Bradford פּראָטעין אַסיי70.
cDNA סינטעז איז דורכגעפירט געווארן מיטן Tetro™ cDNA סינטעז קיט (BIO-65043, Meridian Bioscience) לויט די אינסטרוקציעס פונעם פאבריקאנט מיט געוויסע מאדיפיקאציעס. cDNA איז סינטעזירט געווארן אין 20-μl רעאקציעס ניצנדיג 0.7 ביז 1 μg פון גאנץ RNA. פריימערס זענען אויסגעקליבן געווארן פון פריער פארעפנטלעכטע ארטיקלען 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (טאבעלע S1) און באגלייטנדע פראבעס זענען דיזיינט געווארן ניצנדיג דעם PrimerQuest געצייג פון Integrated DNA Technologies. אלע גענעס פון אינטערעס זענען נארמאליזירט געווארן צום נוקלעארן B2M גען. די גען אויסדרוק פון STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC און OPA1 איז געמאסטן געווארן דורך RT-qPCR. די מאַסטער מיקס האָט אַרייַנגענומען LUNA Taq פּאָלימעראַזע (M3003L, New England Biolabs), 10 μM פאָרווערטס און רעווערס פּריימערס, cDNA, און PCR-גראַד וואַסער צו געבן אַ לעצטן באַנד פון 10 μL פֿאַר יעדער רעאַקציע. עקספּרעסיע פון ​​דיוויזשאַן און פישאַן גענעס (DRP1, MFN1/2) איז געמאָסטן מיט TaqMan מולטיפּלעקס אַסייז. Luna Universal Probe qPCR מאַסטער מיקס (M3004S, New England Biolabs) איז געניצט לויט די מאַנופאַקטורער ס אינסטרוקציעס מיט קליינע מאָדיפיקאַציעס. די מולטיפּלעקס RT-qPCR מאַסטער מיקס אַרייַננעמט 1X LUNA Taq פּאָלימעראַזע, 10 μM פאָרווערטס און רעווערס פּריימערס, 10 μM פּראָבע, cDNA, און PCR-גראַד וואַסער, ריזאַלטינג אין אַ לעצטן באַנד פון 20 μL פֿאַר יעדער רעאַקציע. RT-qPCR איז דורכגעפירט געוואָרן מיט Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—סעריאַל נומער: R0618110). סייקלינג באדינגונגען זענען געוויזן אין טאַבעלע S1. אלע cDNA מוסטערן זענען געווארן פארגרעסערט אין דרייפאכיגע און א סטאנדארט קורווע איז געווארן גענערירט ניצנדיג א סעריע פון ​​צען-פאכיגע פארדילוטונגען. אויסנאמען אין דרייפאכיגע מוסטערן מיט ציקל שוועל סטאנדארט דעוויאציע (Ct) >0.5 זענען ארויסגענומען געווארן פון דער אנאליז צו פארזיכערן דאטן רעפראדוסירבארקייט30,72. רעלאטיווע גען אויסדרוק איז געווארן אויסגערעכנט ניצנדיג די 2-ΔΔCt79 מעטאד.
פּראָטעין מוסטערן (60 μg) זענען געמישט געוואָרן מיט Laemmli לאָודינג באַפער אין אַ 2:1 פּראָפּאָרציע און געלאָפן אויף אַ 12% קאָלירלאָז פּראָטעין געל (Bio-Rad #1610184). פּראָטעאינען זענען טראַנספערד געוואָרן צו אַ PVDF (פּאָליווינילידען פלאָריד) מעמבראַנע (#170-84156, Bio-Rad) ניצנדיק די Trans-Blot Turbo סיסטעם (#170-4155, Bio-Rad). די מעמבראַנע איז געווען בלאָקירט און אינקובירט מיט די פּאַסיקע ערשטיקע אַנטיבאָדיעס (OPA1, MFN1, MFN2, און DRP1) (פאַרדיןנט 1:1000) פֿאַר 48 שעה, נאכגעגאנגען דורך אינקובאַציע מיט צווייטיקע אַנטיבאָדיעס (1:10,000) פֿאַר 1 שעה. מעמבראַנעס זענען דעמאָלט געווען ימאַדזשד ניצנדיק Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) און רעקאָרדירט ​​ניצנדיק אַ Bio-Rad ChemiDoc MP סיסטעם. ImageLab ווערסיע 6.1 איז געניצט געוואָרן פֿאַר Western blot אַנאַליז. דער אריגינעלער געל און בלאט ווערן געוויזן אין פיגור S1. אינפארמאציע וועגן אנטיקערפער ווערט געגעבן אין טאבעלע S2.
דאטן סעטס ווערן פרעזענטירט אלס דער דורכשניט און סטאנדארט ערראר פונעם דורכשניט (SEM) פון לפחות דריי אומאפהענגיקע מוסטערן. דאטן סעטס זענען געטעסט געווארן פאר נארמאליטעט מיטן שאפירא-ווילקס טעסט (סיידן אנדערש געזאגט) פארן אננעמען א גאוסישע פארטיילונג און גלייכע סטאנדארט דעוויאציעס און ווייטער גיין מיט די אנאליזן. אין צוגאב צו אנאליזירן דעם דאטן סעט מיט פישער'ס MEL LSD (p < 0.05), איין-וועג ANOVA (באהאנדלונג קעגן קאנטראל דורכשניט), און דאנעט'ס מערפאכיגע פארגלייך טעסט צו באשטימען באדייטונג (p < 0.05). באדייטנדיקע p ווערטן ווערן געוויזן אין גראף אלס *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אלע סטאטיסטישע אנאליזן און גראפן זענען דורכגעפירט און גענערירט געווארן מיט GraphPad Prism 9.4.0.
פידזשי/אימעדזשעי מאַקראָס פֿאַר TEM בילד אַנאַליז זענען עפנטלעך בנימצא אויף גיטהאַב: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. די מיטאָטשאָנדריאַל געשעעניש לאָקאַטאָר (MEL) מאַקראָ איז עפנטלעך בנימצא אויף גיטהאַב: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
מעיליאַנאַ א., דעווי נם און ווידזשאַיאַ א. מיטאָטשאָנדריאַ: מײַסטער רעגולאַטאָרן פֿון מעטאַבאָליזם, האָמעאָסטאַסיס, סטרעס, אַלטערן און עפּיגענעטיקס. אינדאָנעזיש. ביאָמעדיקאַל וויסנשאַפֿט. דזש. 13, 221–241 (2021).
בן-שחר, ד. פארשידענארטיגע מיטאכאנדריעלע דיספונקציע אין שיצאָפרעניע, קאָמפּלעקס I אלס א מעגלעכער פּאַטאָלאָגישער ציל. שיצאָפרעניע. רעסורס. 187, 3–10 (2017).
באָסע, א. און ביל, MF מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע אין פּאַרקינסאָן'ס קרענק. דזש. נעוראָכעמיסטרי. 139, 216–231 (2016).
שאַרמאַ וו.ק., סינג ט.ג. און מעהטאַ וו. סטרעסט מיטאָטשאָנדריאַ: צילן פון ינוואַזיע אין אַלצהיימערס קרענק. מיטאָטשאָנדריאַ 59, 48–57 (2021).
בעלענגער פּ., דואַרטע דזש.עם.ען., שאָק פּ.פ. און פערעיראַ ג.ק. מיטאָטשאָנדריאַ און דער מוח: ביאָענערגעטיקס און מער. נעוראָטאָקסינס. רעסורס. 36, 219–238 (2019).
ראַנגאַראַדזשו, וו. און אַנדערע. פּלעיאָטראָפּישע מיטאָטשאָנדריאַ: דער אימפּאַקט פון מיטאָטשאָנדריאַ אויף נעוראָנאַלער אַנטוויקלונג און קראַנקייט. דזש. נעוראָסייענס. 39, 8200–8208 (2019).
קאַרדאַנאָ-ראַמאָס, סי. און מאָרעיס, VA מיטאָטשאָנדריאַל ביאָגענעסיס אין נעוראָנען: ווי און וואו. אינטערנאַציאָנאַליטעט. דזש. מאָהר. די וויסנשאַפֿט. 22, 13059 (2021).
יו, ר., לענדאהל, ו., ניסטער, מ. און זשאַאָ, דזש. רעגולאציע פון ​​זויגער מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק: געלעגנהייטן און טשאַלאַנדזשיז. פראָנט. ענדאָקרין. (לאָזאַן) 11, 374 (2020).
כאַטשאָ, מ. און סלעק, ר.ס. מיטאָטשאָנדריאַל דינאַמיק אין דער רעגולאַציע פון ​​נעוראָגענעסיס: פון דעם אַנטוויקלנדיקן ביזן דערוואַקסענעם מוח. אנטוויקלונג. דינאַמיק. 247, 47–53 (2018).