איצט *איצטיקע אַדרעס: קעלן 50931, דייטשלאנד, קעלן עקסאַלאַנס קלאַסטער פאָרשונג אויף צעלולאַרע סטרעס רעספּאָנס אין אַלטערונג-פֿאַרבונדענע קראַנקייטן (CECAD).
די נעוראָדעגענעראַציע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַלע קראַנקייטן ווערט באַטראַכט ווי אומקערלעך ווייל די מעטאַבאַלישע פּלאַסטיסיטי פון נעוראָנען איז באַגרענעצט, אָבער דער עפֿעקט פון מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע אויף דער צעל אויטאָנאָמיע פון ​​נעוראָנאַל מעטאַבאָליזם אין דעם גוף איז שוואַך פֿאַרשטאַנען. דאָ, מיר פאָרשטעלן דעם צעל-ספּעציפֿישן פּראָטעאָם פון פּורקינדזשע נעוראָנען מיט פּראָגרעסיוו OXPHOS דיפֿיציענסי געפֿירט דורך דיסראַפּטעד מיטאָטשאָנדריאַלע פֿוזשאַן דינאַמיק. מיר האָבן געפֿונען אַז מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע האָט טריגערד אַ טיפֿע ענדערונג אין דעם פֿעלד פון פּראָטעאָמיקס, וואָס לעסאָף געפֿירט צו דער סיקווענטשאַלער אַקטיוואַציע פון ​​פּינקטלעכע מעטאַבאַלישע פּראָגראַמען איידער צעל טויט. אומגעריכט, מיר האָבן באַשטימט די קלאָרע אינדוקציע פון ​​פּירווואַט קאַרבאָקסילאַז (PCx) און אַנדערע אַנטי-יידזשינג ענזימען וואָס סופּלעמענטירן די ינטערמידייטס פון די TCA ציקל. אינהיביציע פון ​​PCx האָט פֿאַרערגערט אָקסידאַטיוו דרוק און נעוראָדעגענעראַציע, וואָס ווייַזט אַז אַטעראָסקלעראָוסיס האָט אַ פּראַטעקטיוו עפֿעקט אין נעוראָנען וואָס פֿעלן OXPHOS. די רעסטאָראַציע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַלע פֿוזשאַן אין טערמינאַל דעגענערירטע נעוראָנען קערעקטירט גאָר די מעטאַבאַלישע קעראַקטעריסטיקס, דערמיט פאַרהיטנדיק צעל טויט. אונדזערע געפֿינסן ידענטיפֿיצירן פֿריִער אומבאַקאַנטע פּאַטווייז וואָס געבן ריזיליאַנס צו מיטאָטשאָנדריאַלע דיספֿונקציע און ווייַזן אַז נעוראָדעגענעראַציע קען זיין ריווערסט אפילו אין די שפּעטע סטאַגעס פון דער קראַנקייט.
די צענטראלע ראלע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַ אין אויפהאלטן נעוראָנאַל ענערגיע מעטאַבאָליזם ווערט באַטאָנט דורך די ברייטע נעוראָלאָגישע סימפּטאָמען פֿאַרבונדן מיט מענטשלעכע מיטאָטשאָנדריאַלע קראַנקייטן. רובֿ פון די קראַנקייטן ווערן געפֿירט דורך גענע מוטאַציעס וואָס רעגולירן מיטאָטשאָנדריאַלע גענע אויסדרוק (1, 2) אָדער גענע צעשטערונג פֿאַרבונדן מיט מיטאָטשאָנדריאַלע דינאַמיק, וואָס אומדירעקט ווירקן די פעסטקייט פון מיטאָטשאָנדריאַלע דנאַ (mtDNA) (3, 4). אַרבעט אין כייַע מאָדעלס האט געוויזן אַז אין ענטפער צו מיטאָטשאָנדריאַלע דיספונקציע אין אַרומיקע געוועבן, קאָנסערוואַטיווע מעטאַבאַליק פּאַטווייז (5-7) קענען זיין אַקטיווייטיד, וואָס גיט וויכטיקע אינפֿאָרמאַציע פֿאַר אַ טיפֿע פֿאַרשטאַנד פון די פּאַטאָגענעסיס פון די קאָמפּלעקסע קראַנקייטן. אין שטאַרקן קאַנטראַסט, אונדזער פֿאַרשטאַנד פון די מעטאַבאַליק ענדערונגען פון ספּעציפֿישע צעל טייפּס געפֿירט דורך די אַלגעמיינע דורכפאַל פון מוח מיטאָטשאָנדריאַל אַדענאָסינע טריפאָספאַט (ATP) פּראָדוקציע איז פונדאַמענטאַל (8), וואָס באַטאָנט די נויטווענדיקייט צו ידענטיפיצירן טעראַפּעווטישע צילן וואָס קענען זיין געניצט צו פאַרמייַדן אָדער פאַרהיטן קראַנקייט. פאַרהיטן נעוראָדעגענעראַציע (9). דער מאַנגל פון אינפֿאָרמאַציע איז דער פאַקט אַז נערוו סעלז זענען ברייט באַטראַכט צו האָבן זייער לימיטעד מעטאַבאַליק בייגיקייט קאַמפּערד צו די צעל טייפּס פון אַרומיקע געוועבן (10). געגעבן אַז די צעלן שפּילן אַ צענטראַלע ראָלע אין קאָאָרדינירן די צושטעל פון מעטאַבאָליטן צו נעוראָנען צו העכערן סינאַפּטיש טראַנסמיסיע און רעאַגירן צו שאָדן און קראַנקייט באדינגונגען, די פיייקייט צו אַדאַפּט צעל מעטאַבאָליזאַם צו די טשאַלאַנדזשינג באדינגונגען פון מאַרך געוועב איז כּמעט לימיטעד צו גליאַל צעלן (11-14). אין דערצו, די ינכעראַנט צעלולאַר העטעראָגעניטי פון מאַרך געוועב שטערט לאַרגעלי די לערנען פון מעטאַבאַליק ענדערונגען וואָס פּאַסירן אין ספּעציפיש נעוראָנאַל סאַבגרופּס. ווי אַ רעזולטאַט, קליין איז באַוווסט וועגן די פּינטלעך צעלולאַר און מעטאַבאַליק קאַנסאַקווענסאַז פון מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע אין נעוראָנען.
כּדי צו פֿאַרשטיין די מעטאַבאַלישע קאָנסעקווענצן פֿון מיטאָטשאָנדריאַלער דיספֿונקציע, האָבן מיר אפגעזונדערט פּורקינדזשע נעוראָנען (PNs) אין פֿאַרשידענע סטאַגעס פֿון נעוראָדעגענעראַציע געפֿירט דורך דער צעשטערונג פֿון מיטאָטשאָנדריאַלער אויסערלעכער מעמבראַן פֿוזשאַן (Mfn2). כאָטש Mfn2 מוטאַציעס אין מענטשן זענען פֿאַרבונדן מיט אַ פֿאָרעם פֿון ירושהדיקער מאָטאָר סענסאָרישער נעוראָפּאַטי באַקאַנט ווי טשאַרקאָט-מאַריע-טוט טיפּ 2A (15), איז די קאָנדישאַנעלע צעשטערונג פֿון Mfn2 אין מײַז אַ גוט-באַקאַנטע אינדוקציע פֿון אָקסידאַציע פֿאָספֿאָרילאַציע (OXPHOS) דיספֿונקציע מעטאָדע. די פֿאַרשידענע נעוראָנאַלע סובטיפּעס (16-19) און דער רעזולטאַט נעוראָדעגענעראַטיווער פֿענאָטיפּ ווערן באַגלייט דורך פּראָגרעסיווע נעוראָלאָגישע סימפּטאָמען, אַזאַ ווי באַוועגונגס-שטערונגען (18, 19) אָדער סערעבעלאַרער אַטאַקסיאַ (16). דורך ניצן אַ קאָמבינאַציע פֿון לייבל-פֿרײַ קוואַנטיטאַטיווע (LFQ) פּראָטעאָמיקס, מעטאַבאָלאָמיקס, בילדגעבונג און וויראָלאָגישע מעטאָדן, ווײַזן מיר אַז פּראָגרעסיווע נעוראָדעגענעראַציע שטאַרק אינדוצירט פּירווואַט קאַרבאָקסילאַז (PCx) און אַנדערע פֿאַקטאָרן פֿאַרבונדן מיט אַרטעריאָסקלעראָזיס פֿון PNs אין וויוואָ די אויסדרוק פֿון ענזימען. כדי צו באשטעטיגן די רעלאוואנץ פון דעם געפינס, האבן מיר ספעציפיש אראפ-רעגולירט די אויסדרוק פון PCx אין Mfn2-דעפיציענטע PNs, און געפונען אז די אפעראציע האט פארערגערט אקסידאטיווע סטרעס און פארשנעלערט נעוראדעגענעראציע, אזוי באווייזנדיג אז אזוספערמיע גיט צעל טויט מעטאבאלישע אדאפטאציע. שטרענגע אויסדרוק פון MFN2 קען אינגאנצן ראטעווען די טערמינאלע דעגענעראציע PN מיט שטרענגן OXPHOS דעפיציט, מאסיוון קאנסומאציע פון ​​מיטאכאנדריעלן DNA, און לכאורה צעבראכענעם מיטאכאנדריעלן נעץ, וואס אונטערשטרייכט ווייטער אז די פארעם פון נעוראדעגענעראציע קען זיך אפילו ערהוילן אין דעם פארגעשריטענעם שטאפל פון דער קראנקהייט פאר צעל טויט.
כּדי צו וויזואַליזירן די מיטאָטשאָנדריאַ אין Mfn2 נאַקאַוט PNs, האָבן מיר גענוצט אַ מויז שטאַם וואָס דערלויבט Cre-אָפּהענגיקע מיטאָטשאָנדריאַ צו צילן געל פלורעסענט פּראָטעין (YFP) (mtYFP) (20) Cre אויסדרוק און האָבן געטשעקט די מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע אין וויוואָ. מיר האָבן געפֿונען אַז די צעשטערונג פון די Mfn2 דזשין אין PNs וואָלט פֿירן צו דער גראַדועלער צעטיילונג פון די מיטאָטשאָנדריאַל נעץ (פֿיגור S1A), און די ערשטע ענדערונג איז געפֿונען געוואָרן ביי 3 וואָכן אַלט. אין קאַנטראַסט, די באַדייטנדיקע דעגענעראַציע פון ​​די PN צעל שיכט, ווי באַוויזן דורך דעם פֿאַרלוסט פון קאַלבינדין יממונאָסטיינינג, האָט נישט אָנגעהויבן ביז 12 וואָכן אַלט (פֿיגור 1, A און B). די צייט מיסמאַטש צווישן די ערשטע ענדערונגען אין מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע און די קענטיק אָנהייב פון נעוראָנאַל טויט האָט אונדז געפֿירט צו אויספֿאָרשן די מעטאַבאַליק ענדערונגען טריגערד דורך מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע איידער צעל טויט. מיר האָבן אַנטוויקלט אַ פלאָרעסענס-אַקטיוויירטע צעל סאָרטינג (FACS)-באַזירטע סטראַטעגיע צו איזאָלירן YFP (YFP+)-אויסדריקנדיק PN (פיגור 1C), און אין קאָנטראָל מײַז (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ווייטער באַצייכנט ווי CTRL (פיגור S1B). די אָפּטימיזאַציע פון ​​דער גייטינג סטראַטעגיע באַזירט אויף דער רעלאַטיווער אינטענסיטעט פון דעם YFP סיגנאַל דערמעגלעכט אונדז צו רייניקן דעם YFP+ גוף (YFPhigh) פון PNs פון ניט-PNs (YFPneg) (פיגור S1B) אָדער פּוטאַטיווע פלאָרעסענט אַקסאָן/דענדריטיק פראַגמענטן (YFPlow; פיגור S1D, לינקס), באַשטעטיקט דורך קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ (פיגור S1D, רעכטס). כּדי צו וועריפיצירן די אידענטיטעט פון דער קלאַסיפֿיצירטער פּאָפּולאַציע, האָבן מיר דורכגעפֿירט LFQ פּראָטעאָמיקס און דערנאָך פּרינציפּאַל קאָמפּאָנענט אַנאַליז, און געפֿונען אַז עס איז אַ קלאָרע צעשיידונג צווישן YFPhigh און YFPneg צעלן (פיגור S1C). YFPhigh צעלן האבן געוויזן א נעץ אנרייכערונג פון באקאנטע PNs מארקערס (למשל Calb1, Pcp2, Grid2 און Itpr3) (21, 22), אבער קיין אנרייכערונג פון פראטעאינען וואס ווערן געווענליך אויסגעדריקט אין נעוראנען אדער אנדערע צעל טיפן (פיגור 1D)). א פארגלייך צווישן מוסטערן אין קלאסיפיצירטע YFPhigh צעלן וואס זענען געזאמלט געווארן אין אומאפהענגיקע עקספערימענטן האט געוויזן א קארעלאציע קאעפיציענט > 0.9, וואס ווייזט גוטע רעפראדוסירבארקייט צווישן ביאלאגישע רעפליקאטן (פיגור S1E). אין קורצן, די דאטן האבן באשטעטיקט אונזער פלאן פאר אקוטע און ספעציפישע אפגעזונדערטקייט פון מעגליכע PN. ווייל די L7-cre דרייווער סיסטעם וואס מיר האבן גענוצט אינדוצירט מאסאיק רעקאמבינאציע אין דער ערשטער וואך נאך געבורט (23), האבן מיר אנגעהויבן אויסצושאפן מײַז פון CTRL און קאנדישאנעל (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) זאמלען נעוראנען. נאכדעם וואס רעקאמבינאציע איז פארענדיגט, ווערט עס גערופן Mfn2cKO ביי 4 וואכן פון עלטער. אלס דער ענדפונקט, האבן מיר אויסגעקליבן 8 וואָכן פון עלטער ווען די PN שיכט איז געווען גאַנץ טראָץ די קלאָרע מיטאָטשאָנדריאַלע פראַגמענטאַציע (פיגור 1B און פיגור S1A). אין גאַנצן, האבן מיר קוואַנטיפיצירט אַ גאַנץ פון 3013 פּראָטעאינען, פון וועלכע וועגן 22% זענען געווען באַזירט אויף MitoCarta 2.0 אַנאָטאַציעס באַזירט אויף די מיטאָטשאָנדריאַלע פּראָטעאָמע ווי מיטאָטשאָנדריאַ (פיגור 1E) (פיגור 1E) (24). די דיפערענציעלע גענע אויסדרוק אַנאַליז דורכגעפירט ביי וואָך 8 האט געוויזן אַז בלויז 10.5% פון אַלע פּראָטעאינען האבן געהאט באַטייַטיק ענדערונגען (פיגור 1F און פיגור S1F), פון וועלכע 195 פּראָטעאינען זענען געווען אַראָפּ-רעגולירט און 120 פּראָטעאינען זענען געווען אַרויף-רעגולירט (פיגור 1F). עס איז ווערט צו באַמערקן אַז די "ינאָוואַטיווע פּאַטוויי אַנאַליז" פון דעם דאַטן סעט ווייזט אַז די דיפערענציעל אויסגעדריקטע גענעס געהערן דער הויפּט צו אַ באַגרענעצט סכום פון ספּעציפישע מעטאַבאַליק פּאַטווייז (פיגור 1G). אינטערעסאנט, כאָטש די דאַונרעגולאַציע פון ​​פּאַטווייז פֿאַרבונדן מיט OXPHOS און קאַלסיום סיגנאַלינג באַשטעטיקט די אינדוקציע פון ​​מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע אין פֿוזשאַן-דעפֿיציענט פּנס, אַנדערע קאַטעגאָריעס וואָס דער הויפּט אַרייַנציען אַמינאָ זויער מעטאַבאָליזאַם זענען באַדייטנד אַרויפֿרעגולירט, וואָס איז אין לויט מיט דעם מעטאַבאָליזאַם וואָס פּאַסירט אין מיטאָטשאָנדריאַל פּנס. ריוויירינג איז קאָנסיסטענט.
(א) רעפּרעזענטאַטיווע קאָנפאָקאַלע פאָטאָגראַפֿיעס פֿון סערעבעלאַרע סעקשאַנז פֿון CTRL און Mfn2cKO מײַז, וואָס ווײַזן פּראָגרעסיווע פֿאַרלוסט פֿון PNs (קאַלבינדין, גרוי); די קערנס זענען קאַונטערסטיינד מיט DAPI. (ב) קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון (א) (איין-וועג אַנאַליז פֿון וואַריאַנס, ***P<0.001; n = 4 ביז 6 קרייזן פֿון דרײַ מײַז). (C) עקספּערימענטאַלער וואָרקפֿלאָו. (ד) היץ מאַפּע פֿאַרשפּרייטונג פֿון מאַרקערס ספּעציפֿיש צו פּורקינדזשע (אויבן) און אַנדערע צעל טיפּן (מיטן). (E) ווען דיאַגראַם וואָס ווײַזט די צאָל מיטאָטשאָנדריאַלע פּראָטעאינען אידענטיפֿיצירט אין די קלאַסיפֿיצירטע PN. (F) וואולקאַן פּלאָט פֿון דיפֿערענציעל אויסגעדריקטע פּראָטעאינען אין Mfn2cKO נעוראָנען בײַ 8 וואָכן (באַדײַטונג קאַט-אָף ווערט פֿון 1.3). (G) די קרעאַטיוויטי פּאַטוויי אַנאַליז ווײַזט די פֿינף וויכטיקסטע אַרויף-רעגולאַציע (רויט) און אַראָפּ-רעגולאַציע (בלוי) פּאַטווייז אין די Mfn2cKO PN קלאַסיפֿיצירט ווי 8 וואָכן. דער דורכשניטלעכער אויסדרוק לעוועל פֿון יעדן דעטעקטירטן פּראָטעין ווערט געוויזן. גרוי-סקייל היץ מאַפּע: אַדזשאַסטיד P ווערט. ns, נישט וויכטיק.
פּראָטעאָמיקס דאַטן האָבן געוויזן אַז די פּראָטעין אויסדרוק פון קאָמפּלעקסן I, III, און IV איז ביסלעכווייַז פאַרקלענערט געוואָרן. קאָמפּלעקסן I, III, און IV האָבן אַלע ענטהאַלטן עסענציעלע mtDNA-קאָדירטע סוביוניטן, בשעת קאָמפּלעקס II, וואָס איז געווען בלויז נוקלעאַר-קאָדירט, איז געווען פּראַקטיש נישט באַאיינפלוסט (פיגור 2A און פיגור S2A). . אין איינקלאַנג מיט די פּראָטעאָמיקס רעזולטאַטן, האָט אימונאָכיסטאָכעמיע פון ​​סערעבעלאַר געוועב סעקשאַנז געוויזן אַז די MTCO1 (מיטאָטשאָנדריאַל ציטאָכראָם C אָקסידאַז סוביוניט 1) סוביוניט לעוועל פון קאָמפּלעקס IV אין PN איז ביסלעכווייַז פאַרקלענערט געוואָרן (פיגור 2B). די mtDNA-קאָדירטע סוביוניט Mtatp8 איז באַדייטנד פאַרקלענערט געוואָרן (פיגור S2A), בשעת די סטאַביל-שטאַט לעוועל פון די נוקלעאַר-קאָדירטע ATP סינטהאַז סוביוניט איז געבליבן אַנטשיינדזשד, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט די באַקאַנטע סטאַביל ATP סינטהאַז סובאַסעמבלי F1 קאָמפּלעקס ווען mtDNA אויסדרוק איז סטאַביל. די פאָרמאַציע איז קאָנסיסטענט. ינטעראַפּט (7). אן אויספארשונג פון דעם mtDNA לעוועל אין די סארטירטע Mfn2cKO PNs דורך רעאל-צייט פאלימעראז קייט רעאקציע (qPCR) האט באשטעטיקט די גראדועלער פארקלענערונג אין mtDNA קאפיע נומער. אין פארגלייך מיט דער קאנטראל גרופע, ביי 8 וואכן פון עלטער, איז נאר בערך 20% פון דעם mtDNA לעוועל געבליבן (פיגור 2C). אין איינקלאנג מיט די רעזולטאטן, איז די קאנפאקאלע מיקראסקאפיע פארבונג פון Mfn2cKO PNs גענוצט געווארן צו דעטעקטירן DNA, וואס ווייזט דעם צייט-אפהענגיקן פארברוך פון מיטאכאנדריעלע נוקלעאטידן (פיגור 2D). מיר האבן געפונען אז נאר עטלעכע קאנדידאטן וואס זענען פארמישט אין מיטאכאנדריעלע פראטעין דעגראדאציע און סטרעס רעאקציע זענען געווען פארגרעסערט, אריינגערעכנט Lonp1, Afg3l2 און Clpx, און OXPHOS קאמפלעקס אסעמבלי פאקטארן. קיין באדייטנדע ענדערונגען אין די לעוועלס פון פראטעאינען וואס זענען פארמישט אין אפאפטאסיס זענען נישט דעטעקטירט געווארן (פיגור S2B). ענליך, האבן מיר געפונען אז די מיטאכאנדריע און ענדאפלאזמישע רעטיקולום קאנאלן וואס זענען פארמישט אין קאלציום טראנספארט האבן נאר קליינע ענדערונגען (פיגור S2C). דערצו, די עוואַלואַציע פון ​​אויטאָפאַגיע-פֿאַרבונדענע פּראָטעאינען האָט נישט געפֿונען קיין באַדייטנדיקע ענדערונגען, וואָס איז קאָנסיסטענט מיט דער קענטיקער אינדוקציע פון ​​אויטאָפאַגאָסאָמען באמערקט אין וויוואָ דורך אימונאָכיסטאָכעמיע און עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי (פיגור S3). אָבער, די פּראָגרעסיווע OXPHOS דיספֿונקציע אין PNs ווערט באַגלייט דורך קלאָרע אַלטראַסטראַקטשעראַלע מיטאָטשאָנדריאַלע ענדערונגען. מיטאָטשאָנדריאַלע קלאַסטערס קענען געזען ווערן אין די צעל קערפּערס און דענדריטיק ביימער פון Mfn2cKO PNs אַלט 5 און 8 וואָכן, און די ינער מעמבראַן סטרוקטור האָט דורכגעמאַכט טיפֿע ענדערונגען (פיגור S4, A און B). קאָנסיסטענט מיט די אַלטראַסטראַקטשעראַלע ענדערונגען און אַ באַדייטנדיקע פאַרקלענערונג אין mtDNA, אַנאַליז פון אַקוטע סערעבראַל סערעבעללאַר סלייסיז מיט טעטראַמעטהילראָדאַמין מעטהיל עסטער (TMRM) האָט געוויזן אַז די מיטאָטשאָנדריאַלע מעמבראַן פּאָטענציעל אין Mfn2cKO PNs איז באַדייטנדיק פאַרקלענערט געוואָרן (פיגור S4C).
(א) צייט-קורס אנאליז פון די אויסדרוק לעוועל פון OXPHOS קאמפלעקס. באטראכט נאר פראטעאינען מיט P<0.05 ביי 8 וואכן (צוויי-וועג ANOVA). געפינטלטע ליניע: קיין קארעקציע קעגן CTRL. (ב) לינקס: א ביישפיל פון א צערעבעלארער סעקציע באצייכנט מיט אנטי-MTCO1 אנטיקערפער (וואג באר, 20 μm). די שטח פארנומען דורך פּורקינדזשע צעל קערפערס איז באדעקט מיט געל. רעכטס: קוואנטיפיקאציע פון ​​MTCO1 לעוועלס (איין-וועג אנאליז פון וועריאנץ; n = 7 ביז 20 צעלן אנאליזירט פון דריי מײַז). (C) qPCR אנאליז פון mtDNA קאפיע נומער אין די סארטירטע PN (איין-וועג אנאליז פון וועריאנץ; n = 3 ביז 7 מײַז). (ד) לינקס: א ביישפיל פון א צערעבעלארער סלייס באצייכנט מיט אן אנטי-DNA אנטיקערפער (וואג באר, 20 μm). די שטח פארנומען דורך פּורקינדזשע צעל קערפערס איז באדעקט מיט געל. רעכטס: קוואנטיפיקאציע פון ​​mtDNA לעזיעס (איין-וועג אנאליז פון וועריאנץ; n = 5 ביז 9 צעלן פון דריי מײַז). (E) א ביישפּיל פון אַן אַקוטע סערעבעלאַר סעקציע וואָס ווייזט מיטאָYFP + פּורקינדזשע צעלן (פייַל) אין אַ גאַנצע-צעל פּאַטש קלאַמער רעקאָרדינג. (F) קוואַנטיפיקאַציע פון ​​IV קורווע. (G) רעפּרעזענטאַטיווע רעקאָרדינגס פון דעפּאָלאַרייזינג קראַנט ינדזשעקשאַן אין CTRL און Mfn2cKO פּורקינדזשע צעלן. אויבערשטער שפּור: דער ערשטער פּולס וואָס האָט טריגערט AP. אונטערשטער שפּור: מאַקסימום AP אָפטקייט. (H) קוואַנטיפיקאַציע פון ​​פּאָסטסינאַפּטישע ספּאָנטאַנע ינפּוץ (sPSPs). די רעפּרעזענטאַטיווע רעקאָרדינג שפּור און איר זום פאַרהעלטעניש זענען געוויזן אין (I). איין-וועג אַנאַליז פון וואַריאַנס אַנאַליזירט n = 5 צו 20 צעלן פון דריי מײַז. דאַטן זענען אויסגעדריקט ווי מיטל±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) רעפּרעזענטאַטיווע שפּורן פון ספּאָנטאַנע AP רעקאָרדירט ​​ניצן די פּערפאָראַטעד פּאַטש קלאַמער מאָדע. אויבערשטער שפּור: מאַקסימום AP אָפטקייט. אונטערשטער שפּור: זום פון אַ איין AP. (K) קוואַנטיפיצירן די דורכשניטלעך און מאַקסימום AP אָפטקייט לויט (J). מאַן-וויטני טעסט; n = 5 צעלן זענען אַנאַליזירט פון פיר מײַז. דאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי מיטל ± SEM; נישט וויכטיק.
קלארע OXPHOS שאדן איז דעטעקטירט געווארן אין די 8-וואכן-אלטע Mfn2cKO PN, וואס ווייזט אז די פיזיאלאגישע פונקציע פון ​​נעוראנען איז שטארק אבנארמאל. דעריבער, האבן מיר אנאליזירט די פאסיווע עלעקטרישע אייגנשאפטן פון OXPHOS-דעפיציענט נעוראנען ביי 4 ביז 5 וואכן און 7 ביז 8 וואכן דורך דורכפירן גאנצע-צעל פּאַטש קלאַמפּ רעקאָרדינגס אין אַקוטע סערעבעללאַר סלייסיז (פיגור 2E). אומגעריכט, די דורכשניטלעך רו מעמבראַן פּאָטענציעל און אינפוט קעגנשטעל פון Mfn2cKO נעוראנען זענען געווען ענלעך צו די קאָנטראָל, כאָטש עס זענען געווען סאַטאַל דיפעראַנסיז צווישן סעלז (טאַבעלע 1). סימילאַרלי, ביי 4 ביז 5 וואָכן פון עלטער, קיין באַטייַטיק ענדערונגען אין די קראַנט-וואָולטידזש באַציִונג (IV קורווע) זענען געפֿונען געוואָרן (פיגור 2F). אָבער, קיין Mfn2cKO נעוראנען 7 ביז 8 וואָכן אַלט האָבן נישט איבערגעלעבט די IV רעזשים (היפּערפּאָלאַריזאַטיאָן שריט), וואס ווייזט אז עס איז אַ קלאָר סענסיטיוויטי צו היפּערפּאָלאַריזאַטיאָן פּאָטענציעל אין דעם שפּעט בינע. אין קאנטראסט, אין Mfn2cKO נעוראנען, די דעפאלאריזירנדע שטראמען וואס פאראורזאכן איבערחזרנדיקע עקשאן פאטענציאל (AP) אויסלאזונגען זענען גוט טאלערירט, וואס ווייזט אז זייערע אלגעמיינע אויסלאזונג מוסטערן זענען נישט באדייטנד אנדערש פון די פון 8-וואכן-אלטע קאנטראל נעוראנען (טאבעלע 1 און פיגור 2G). ענליך, די פרעקווענץ און אמפליטודע פון ​​ספאנטאנישע פאסטסינפטישע שטראמען (sPSCs) זענען געווען פארגלייכבאר צו די פון די קאנטראל גרופע, און די פרעקווענץ פון געשעענישן איז געוואקסן פון 4 וואכן צו 5 וואכן צו 7 וואכן צו 8 וואכן מיט א ענליכער פארגרעסערונג (פיגור 2, H און I). די פעריאד פון סינאפטישער מאטוראציע אין PNs (25). ענליכע רעזולטאטן זענען באקומען נאך פערפארירטע PNs פאטשעס. די קאנפיגוראציע פארמיידט די מעגליכע קאמפענסאציע פון ​​צעלולארע ATP חסרונות, ווי עס קען פאסירן אין גאנצע-צעל פאטש קלעמ רעקארדינג. אין באזונדער, די רוה מעמבראן פאטענציאל און ספאנטאנישע פייער פרעקווענץ פון Mfn2cKO נעוראנען זענען נישט באאיינפלוסט געווארן (פיגור 2, J און K). אין קורצן, די רעזולטאַטן ווײַזן אַז PNs מיט קלאָרע OXPHOS דיספֿונקציע קענען גוט קאָפּע מיט הויך-פרעקווענץ דיסטשאַרדזש פּאַטערנז, וואָס ווײַזט אַז עס איז אַ קאָמפּענסאַציע מעקאַניזאַם וואָס אַלאַוז זיי צו האַלטן כּמעט נאָרמאַל עלעקטראָפֿיזיאָלאָגישע רעאַקציעס.
דאטן ווערן אויסגעדריקט אלס דורכשניט ± SEM (איין-וועג אנאליז פון וועריאנץ, האָלם-סידאַק'ס מולטיפל קאמפעריישן טעסט; *P<0.05). די איינהייט נומער ווערט אנגעצייכנט מיט קלאַמערן.
מיר האָבן זיך גענומען אויספאָרשן צי קיין קאַטעגאָריע אין דעם פּראָטעאָמיקס דאַטאַסעט (פיגור 1G) כולל וועגן וואָס קענען קעגנשטעלן שווערע OXPHOS דיפישאַנסי, און דערמיט דערקלערן פאַרוואָס אַפעקטירטע PN קענען האַלטן כּמעט נאָרמאַל עלעקטראָפֿיזיאָלאָגיע (פיגור 2, E ביז K). פּראָטעאָמיקס אַנאַליז האָט געוויזן אַז די ענזימען וואָס זענען ינוואַלווד אין די קאַטאַבאָליזם פון צווייַגיק קייט אַמינאָ זויערן (BCAA) זענען באַדייטנד אַרויפגערעגיאַלירט (פיגור 3A און פיגור S5A), און דער לעצט פּראָדוקט אַסעטיל-CoA (CoA) אָדער סוקסיניל CoA קענען סופּפּלעמענטירן די טריקאַרבאָקסילאַטעס אין אַרטעריאָסקלעראָוסיס זויער (TCA) ציקל. מיר האָבן געפֿונען אַז דער אינהאַלט פון BCAA טראַנסאַמינאַסע 1 (BCAT1) און BCAT2 זענען ביידע געוואַקסן. זיי קאַטאַליזירן דעם ערשטן שריט פון BCAA קאַטאַבאָליזם דורך דזשענערייטינג גלוטאַמאַט פון α-קעטאָגלוטאַראַט (26). אלע סוביוניטן וואס מאכן אויס דעם צווייג-קייט קעטא זויער דעהידראגענעז (BCKD) קאמפלעקס זענען פארגרעסערט (דער קאמפלעקס קאטאליזירט די נאכפאלגנדע און אומקערלעכע דעקארבאָקסילאַציע פון ​​דעם רעזולטירנדיקן BCAA קוילן סקעלעט) (פיגור 3A און פיגור S5A). אבער, קיין קלארע ענדערונגען אין BCAA אליין זענען נישט געפונען געווארן אין דעם סארטירטן PN, וואס קען זיין צוליב דעם פארגרעסערטן צעלולארן אויפנעמען פון די עסענציעלע אמינא זויערן אדער דעם באנוץ פון אנדערע קוועלער (גלוקאז אדער לאקטישע זויער) צו דערגאנצן דעם TCA ציקל (פיגור S5B). PNs וואס פעלן OXPHOS האבן אויך געוויזן פארגרעסערטע גלוטאמין דעקאמפאזיציע און טראנסאמינאציע אקטיוויטעטן ביי 8 וואכן עלטער, וואס קען רעפלעקטירט ווערן דורך דעם פארגרעסערטן רעגולאציע פון ​​די מיטאכאנדריעלע ענזימען גלוטאמינאז (GLS) און גלוטאמין פּירווואַט טראנסאמינאז 2 (GPT2) (פיגור 3, A און C). עס איז ווערט צו באַמערקן אַז די אַרויפֿרעגולאַציע פֿון GLS איז באַגרענעצט צו די ספּלייסט יסאָפֿאָרם גלוטאַמינאַז C (GLS-GAC) (די ענדערונג פֿון Mfn2cKO/CTRL איז אַרום 4.5 מאָל גרעסער, P = 0.05), און איר ספּעציפֿישע אַרויפֿרעגולאַציע אין ראַק געוועבן קען שטיצן מיטאָטשאָנדריאַל ביאָענערגיע. (27).
(א) די היץ מאַפּע ווייזט די פאַרהאַלטונג ענדערונג אין פּראָטעין מדרגה פֿאַר די ספּעציפֿישע וועג ביי 8 וואָכן. (ב) בייַשפּיל פון אַ סערעבעללאַר סלייסיז לייבאַלד מיט אַנטי-PCx אַנטיבאָדי (וואָג באַר, 20 μm). דער געלער פייַל ווייזט צו די פּורקינדזשע צעל גוף. (C) צייט קורס פּראָטעין אויסדרוק אַנאַליסיס אידענטיפיצירט ווי אַ וויכטיק קאַנדידאַט פֿאַר אַטעראָסקלעראָוסיס (קייפל ט-טעסט, *FDR <5%; n = 3-5 מײַז). (ד) אויבן: א סכעמאַטיש דיאַגראַמע ווייַזונג די פאַרשידענע וועגן פון אַרייַן די לייבאַלד טשאַד קאַנטיינד אין די [1-13C]פּירווואַט טרייסער (ד"ה, דורך PDH אָדער טראַנס-אַרטעריאַל וועג). אונטן: די וויאָלין טשאַרט ווייזט די פּראָצענט פון איין-לייבאַלד טשאַד (M1) קאָנווערטעד צו אַספּאַרטיק זויער, סיטריק זויער און מאַליק זויער נאָך לייבאַלינג אַקוטע סערעבעללאַר סלייסיז מיט [1-13C]פּירווואַט (פּערד ט-טעסט; ** P <0.01). (E) קאָמפּרעהענסיוו צייט געשיכטע אַנאַליסיס פון די אנגעוויזן וועג. באַטראַכטן בלויז פּראָטעינס מיט P<0.05 ביי 8 וואָכן. געשטריכלטע ליניע: קיין אַדזשאַסטמענט ווערט (צוויי-וועג אַנאַליז פון וועריאַנס; * P <0.05; *** P <0.001). דאַטן זענען אויסגעדריקט ווי דורכשניטלעך ± SEM.
אין אונדזער אנאליז, איז BCAA קאטאבאליזם געווארן איינער פון די שליסל אויפ-רעגולאציע וועגן. דער פאקט ווייזט שטארק אז דער ווענטילאציע וואליום וואס גייט אריין אין דעם TCA ציקל קען זיין געטוישט אין PN וואס פעלט OXPHOS. דאס קען רעפרעזענטירן א הויפט פארעם פון נעוראנאל מעטאבאלישער איבער-וויירינג, וואס קען האבן א דירעקטן איינפלוס אויף נעוראנאלער פיזיאלאגיע און איבערלעבונג בעת די אויפהאלטונג פון שווערע OXPHOS דיספונקציע. אין איינקלאנג מיט דעם היפאטעזע, האבן מיר געפונען אז דער הויפט אנטי-אטעראסקלעראטישער ענזיים PCx איז אויפ-רעגולירט (Mfn2cKO/CTRL ענדערט זיך בערך 1.5 מאל; פיגור 3A), וואס קאטאליזירט די קאנווערזיע פון ​​פּירווואט צו אקסאלאאַסעטאט (28), וואס מען גלויבט איז אין מוח געוועב. די אויסדרוק אין איז באגרענעצט צו אסטראסיטן (29, 30). אין איינקלאנג מיט די פראטעאמיקס רעזולטאטן, האט קאנפאקאלע מיקראסקאפיע געוויזן אז PCx אויסדרוק איז ספעציפיש און באדייטנד געוואקסן אין OXPHOS-דעפיציענט PNs, בשעת PCx רעאקטיוויטעט איז געווען מערסטנס באגרענעצט צו די שכיינישע בערגמאן גליאל צעלן פון די קאנטראל (פיגור 3B). כדי פונקציאָנעל צו טעסטן די באמערקטע ארויפגייאונג פון PCx, האבן מיר באהאנדלט אקוטע סערעבעללאר סלייסיז מיט [1-13C]פּירווואַט טרעיסער. ווען פּירווואַט איז אָקסידירט געוואָרן דורך פּירווואַט דעהידראָגענאַזע (PDH), איז זיין איזאָטאָפּ לייבל פאַרשוואונדן, אָבער ווערט איינגעארבעט אין די TCA ציקל אינטערמידיעטן ווען פּירווואַט ווערט מעטאַבאָליזירט דורך וואַסקולערע רעאַקציעס (פיגור 3D). אין שטיצע פון ​​אונדזער פּראָטעאָמיקס דאַטן, האבן מיר באמערקט אַ גרויסע צאָל מאַרקערס פון דעם טרעיסער אין די אַספּאַרטיק זויער פון Mfn2cKO סלייסיז, בשעת סיטריק זויער און מאַליק זויער האבן אויך געהאט אַ מעסיק טענדענץ, כאָטש נישט באַטייַטיק (פיגור 3D).
אין די דאָפּאַמין נעוראָנען פון מיטאָפּאַרק מײַז מיט מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע געפֿירט דורך דאָפּאַמין נעוראָנען ספּעציפֿיש צעשטערן די מיטאָטשאָנדריאַל טראַנסקריפּציע פֿאַקטאָר אַ דזשין (Tfam) (פֿיגור S6B), PCx אויסדרוק איז אויך באַדײַטנדיק אַרויפֿרעגולירט (31), וואָס ווײַזט אַז אַצעטאָן זויער אַרטעריאָסקלעראָזיס די אויפֿטרעטונג פֿון דער קראַנקייט איז רעגולירט בעת די דיספֿונקציע פֿון נעוראָנאַל OXPHOS אין דעם גוף. עס איז ווערט צו באַמערקן אַז עס איז געפֿונען געוואָרן אַז יינציק ענזימען (32-34) וואָס קען זײַן אויסגעדריקט אין נעוראָנען וואָס קען זײַן פֿאַרבונדן מיט אַרטעריאָסקלעראָזיס זענען באַדײַטנדיק אַרויפֿרעגולירט אין PNs וואָס פֿעלן אין OXPHOS, אַזאַ ווי פּראָפּיאָניל-CoA קאַרבאָקסילאַז (PCC-A), מאַלאָניל-CoA קאָנווערטירט פּראָפּיאָניל-CoA צו סוקסיניל-CoA און מיטאָטשאָנדריאַל מאַליק ענזיים 3 (ME3), וועמענס הויפּט ראָלע איז צו צוריקקריגן פּירווואַט פֿון מאַלאַט (פֿיגור 3, A און C) (33, 35). דערצו, האבן מיר געפונען א באדייטנדיקע פארגרעסערונג אין דעם Pdk3 ענזיים, וואס פאספארילירט און אזוי אינאקטיוויזירט PDH (36), בשעת קיין ענדערונגען זענען נישט דעטעקטירט געווארן אין דעם Pdp1 ענזיים וואס אקטיוויזירט PDH אדער דעם PDH ענזיים קאמפלעקס אליין (פיגור 3A). קאנסיסטענט, אין Mern2cKO PNs, איז די פאספארילאציע פון ​​דער α1 סוביוניט α (PDHE1α) סוביוניט פון דעם פּירווואַט דעהידראָגענאַזע E1 קאמפאנענט פון דעם PDH קאמפלעקס אין Ser293 (באקאנט צו אינהיביטירן די ענזיים טעטיקייט פון PDH) פארשטארקט געווארן (פיגור S6C) (פיגור S6C). פּירווואַט האט נישט קיין וואסקולערן צוטריט.
צום סוף, האבן מיר געפונען אז דער סופער וועג פון סערין און גליצין ביאָסינטעז, דער פארבונדענער מיטאָטשאָנדריאַלער פאָלאַטע (1C) ציקל און פּראָלין ביאָסינטעז (פיגור 1G און פיגור S5C) זענען אלע באדייטנד ארויפגערעגלט, לויט באריכטן, בעת דעם אקטיוואציע פראצעס. די ארומיגע געוועבן ווערן אקטיוויזירט מיט מיטאָטשאָנדריאַלער דיספונקציע (5-7). קאנפאָקאַלע אנאליז וואס שטיצט די פּראָטעאָמיקס דאטן האט געוויזן אז אין PN מיט OXPHOS פעלנדיק, זענען סערעבעלאַרע סלייסיז פון 8-וואָכן-אַלטע מײַז אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו סערין הידראָקסימעטהילטראַנספעראַזע 2 (SHMT2), א שליסל ענזיים פון דעם מיטאָטשאָנדריאַלן פאָלאַטע ציקל. באדייטנדע אימונע רעאקציע (פיגור S5D). אין 13 CU-גלוקאָז-אינקובירטע אקוטע סערעבעלאַרע סלייסיז, האבן מעטאַבאַלישע טרעיסינג עקספּערימענטן ווייטער באשטעטיקט די ארויפגערעגלונג פון סערין און פּראָלין ביאָסינטעז, וואָס ווייזט אז דער פלוס פון קאַרבאָן יסאָפאָרמען אין סערין און פּראָלין איז געוואקסן (פיגור S5E). זינט די רעאַקציעס וואָס ווערן פּראָמאָווירט דורך GLS און GPT2 זענען פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר דער סינטעז פון גלוטאַמאַט פֿון גלוטאַמין און די טראַנסאַמינאַציע צווישן גלוטאַמאַט און α-קעטאָגלוטאַראַט, ווײַזט זייער ארויפגיין אויף די ענדערונגען אַז OXPHOS-דעפֿיציענטע נײַראָנען האָבן אַ געוואקסענע נאָכפֿראַגע פֿאַר גלוטאַמאַט. דאָס קען זײַן אַימעד צו האַלטן די געוואקסענע ביאָסינטעז פֿון פּראָלין (פֿיגור S5C). אין קאָנטראַסט צו די ענדערונגען, האָט אַ פּראָטעאָמישע אַנאַליז פֿון סערעבעלאַרע אַסטראָציטן פֿון PN-ספּעציפֿישע Mfn2cKO מײַז געוויזן אַז די פּאַטהוועיס (אַרײַנגערעכנט אַלע אַנטיפּעראָקסידאַזעס) האָבן זיך נישט באַדײַטנד געביטן אין אויסדרוק, אַזוי דעמאָנסטרירנדיק אַז די מעטאַבאַלישע רידערעקשאַן איז סעלעקטיוו צו דעגראַדירטן PN (פֿיגור S6, D ביז G).
אין קורצן, די אנאליזן האבן אנטפלעקט באדייטנד אנדערע מוסטערן פון צייטווייליגע אקטיוואציע פון ​​ספעציפישע מעטאבאלישע וועגן אין פּנ'ס. כאטש אומנארמאלע נעוראנאלע מיטאכאנדריעלע פונקציע קען פירן צו פריע אטאקעריקלאז און 1C רעמאדעלינג (פיגור 3E און פיגור S5C), און אפילו פארזעבארע ענדערונגען אין דער אויסדרוק פון I און IV קאמפלעקסן, די ענדערונגען אין סערין דע נאָוואָ סינטעז זענען ערשט קלאר געווארן אין די שפעטע סטאדיעס. OXPHOS דיספונקציע (פיגור 3E און פיגור S5C). די געפינסן דעפינירן א סיקווענטשעל פראצעס אין וועלכן די סטרעס-אינדוצירטע מיטאכאנדריעלע (1C ציקל) און ציטאפלאזמישע (סערין ביאסינטעז) רעאגירן סינערגיסטיש מיט דער פארגרעסערונג אין אטאקעריקלאז אין דעם TCA ציקל צו איבערפארעמען נעוראנאלן מעטאבאליזם.
8-וואָכן-אַלטע OXPHOS-דעפיציטאַנטע פּ.נ.ס. קענען האַלטן הויך-פרעקווענץ עקסייטיישאַן טעטיקייט און דורכגיין באַדייטנדיק מעטאַבאַליק ריקאַנעקשאַן צו קאָמפּענסירן פֿאַר מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע. די ענטדעקונג ברענגט אַרויף אַן אינטערעסאַנטע מעגלעכקייט אַז אפילו אין דעם מאָמענט, קען די צעלן אויך באַקומען טעראַפּעווטישע אריינמישונג צו פאַרהאַלטן אָדער פאַרמייַדן נעוראָדעגענעראַציע. שפּעט. מיר האָבן סאָלווד די מעגלעכקייט דורך צוויי אומאָפּהענגיקע אריינמישונגען. אין דער ערשטער מעטאָדע, האָבן מיר דיזיינד אַ Cre-אָפּהענגיק אַדענאָ-אַססאָסיאַטעד ווירוס (AAV) וועקטאָר אַזוי אַז MFN2 קען זיין סעלעקטיוו אויסגעדריקט אין OXPHOS-דעפיציטאַנטע פּ.נ.ס. אין וויוואָ (פיגור S7A). די AAV וואָס קאָדירט MFN2 און די פלורעסענט רעפּאָרטער דזשין mCherry (Mfn2-AAV) זענען וועראַפייד אין ערשטיק נעוראָן קולטורן אין וויטראָ, וואָס האָט געפֿירט צו MFN2 צו זיין אויסגעדריקט אין אַ Cre-אָפּהענגיק שטייגער און געראַטעוועט די מיטאָטשאָנדריאַל מאָרפאָלאָגיע, דערמיט פאַרהיטן נעוראָמוטאַציע אין Mfn2cKO נעוראָנס (פיגור S7, B, D און E). דערנאך, האבן מיר דורכגעפירט אין וויווא עקספערימענטן צו סטערעאטאקטיש צושטעלן 8-וואכן-אלט Mfn2-AAV צו די סערעבעלאר קארטעקס פון Mfn2cKO און קאנטראל מײַז, און אנאליזירט 12-וואכן-אלט מײַז (פיגור 4A). די באהאנדלטע Mfn2cKO מײַז זענען געשטארבן (פיגור 1, A און B) (16). וויראלע טראנסדוקציע אין וויווא האט רעזולטירט אין סעלעקטיווער אויסדרוק פון PN אין עטלעכע סערעבעלארע קרייזן (פיגור S7, G און H). די אינדזשעקציע פון ​​די קאנטראל AAV וואס אויסדריקט נאר mCherry (Ctrl-AAV) האט נישט געהאט קיין באדייטנדיקע ווירקונג אויף די גראד פון נעוראדעגענעראציע אין Mfn2cKO חיות. אין קאנטראסט, די אנאליז פון Mfn2cKOs טראנסדוצירט מיט Mfn2-AAV האט געוויזן א באדייטנדיקן שוץ-ווירקונג פון די PN צעל שיכט (פיגור 4, B און C). אין באזונדער, די נעוראן געדיכטקייט שיינט צו זיין כמעט נישט אונטערשיידלעך פון די קאנטראל חיות (פיגור 4, B און C, און פיגור S7, H און I). די אויסדרוק פון MFN1 אבער נישט MFN2 איז גלייך עפעקטיוו אין ראטעווען נעוראנאלן טויט (פיגור 4C און פיגור S7, C און F), וואס ווייזט אז די אויסדרוק פון עקטאפישער MFN1 קען עפעקטיוו סופלעמענטירן דעם מאנגל פון MFN2. ווייטערדיגע אנאליז אויף דעם איינציקן PN לעוועל האט געוויזן אז Mfn2-AAV האט גרויסענטייל געראַטעוועט די אולטראסטרוקטור פון מיטאָטשאָנדריאַ, נאָרמאַליזירט mtDNA לעוועלס, און אומגעקערט די הויכע אויסדרוק פון דעם אַנטי-אַנגיאָגענעסיס מאַרקער PCx ​​(פיגור 4, C ביז E). וויזועלע דורכקוק פון די געראַטעוועטע Mfn2cKO מײַז אין א רו-שטאַנד האט געוויזן אז זייער האַלטונג און מאָטאָר סימפּטאָמען (באַוועגונג S1 ביז S3) זענען פֿאַרבעסערט געוואָרן. אין מסקנא, די עקספּערימענטן ווײַזן אז אַ פֿאַרשפּעטיקטע ווידער-איינפֿירונג פון MFN2 אין PNs וואָס האָבן שווערע חסרונות אין OXPHOS איז גענוג צו פאַרקערט mtDNA קאָנסומאַציע און אינדוצירן אַטעראָסקלעראָוסיס, דערמיט פאַרהיטן אַקסאָן דעגענעראַציע און נעוראנאלן טויט אין וויוואָ.
(א) א סכעמע וואס ווייזט דעם עקספערימענטאלן פלאן פארן אינדזשעקטירן AAV וואס קאדירט MFN2 ווען דער אנגעגעבענער מעטאבאלישער וועג ווערט אקטיוויזירט. (ב) רעפרעזענטאטיווע קאנפאקאלע בילדער פון 12-וואכן-אלטע סערעבעלארע סלייסעס טראנסדוצירט ביי 8 וואכן אין Mfn2cKO מײַז און באצייכנט מיט אנטי-קאלבינדין אנטיקערפער. רעכטס: סקאלירונג פון אקסאן פיבערס. די סקאלע פון ​​די אקסאן זום איז 450 און 75 μm. (C) לינקס: קוואנטיפיקאציע פון ​​פּורקינדזשע צעל געדיכטקייט אין די AAV טראנסדוקציע שלייף (AAV+) (איין-וועג אנאליז פון וועריאנץ; n = 3 מײַז). רעכטס: mtDNA פאקוס אנאליז אין טראנסדוצירט PN ביי וואך 12 (אנגעפארע ט-טעסט; n = 6 צעלן פון דריי מײַז). * P <0.05; ** P <0.01. (D) רעפרעזענטאטיווע טראנסמיסיע עלעקטראן מיקראגראפן פון PNs פון Mfn2cKO סערעבעלארע סעקשאַנז טראנסדוצירט מיט די אנגעגעבענע וויראלע וועקטאָרן. די ראָזעווע מאַסקע אילוסטרירט דעם שטח פאַרנומען דורך דענדריטן, און דער געלער פּונקטירטער קוואַדראַט אילוסטרירט דעם זום וואָס ווערט געגעבן אויף דער רעכטער זייט; n רעפּרעזענטירט דעם קערן. סקאַלע באַר, 1μm. (E) ווייזט אַ בייַשפּיל פון PCx פֿאַרבונג אין PN טראַנסדוסירט ביי 12 וואָכן. סקאַלע באַר, 20μm. OE, איבערעקספּרעסיע; FC, פאַרלייגן ענדערונג.
צום סוף, האבן מיר אויסגעפארשט די וויכטיקייט פון פעראקסידאז-אינדוצירטע צעל איבערלעבונג אין פּ.נ.ס. וואס האבן דערפארן OXPHOS דיספונקציע. מיר האבן גענערירט mCherry וואס קאדירט AAV-shRNA (קורצע האָרנעפּל RNA) ספעציפיש צילנדיק מויז PCx mRNA (AAV-shPCx), און אינדזשעקטירט דעם ווירוס אדער זיין סקראַמבאַלד קאָנטראָל (AAV-scr) אין די סערעבעללום פון Mfn2cKO מײַז. די אינדזשעקציע איז דורכגעפירט געוואָרן אין דער פערטער וואָך פון עלטער (פיגור 5A) צו דערגרייכן עפעקטיוו PCx נאַקדאַון בעת ​​דער פּעריאָדע ווען PCx אויסדרוק איז געוואקסן (פיגור 3C) און די פּ.נ. צעל שיכט איז נאָך געווען גאַנץ (פיגור 1A). עס איז ווערט צו באַמערקן אַז נאַקדאַון PCx (פיגור S8A) פירט צו אַ באַטייטיק אַקסעלעריישאַן פון פּ.נ. טויט, וואָס איז לימיטעד צו די ינפעקטאַד רינג (פיגור 5, B און C). כּדי צו פֿאַרשטיין דעם מעכאַניזם פֿון די מעטאַבאַלישע עפֿעקטן וואָס ווערן געפֿירט דורך PCx אַרויפֿרעגולאַציע, האָבן מיר שטודירט דעם רעדאָקס סטאַטוס פֿון PNs נאָכדעם וואָס PCx נאַקדאַון און AAV-מעדיאַטעד אָפּטיש ביאָסענסאָר Grx1-roGFP2 זענען סיימאַלטייניאַס אויסגעדריקט געוואָרן (פֿיגור S8, B ביז D) כּדי צו עוואַלויִרן גלוטאַטהיאָן. די רעלאַטיווע ענדערונג פֿון פּעפּטיד רעדאָקס פּאָטענציעל (38). דערנאָך האָבן מיר דורכגעפֿירט צוויי-פֿאָטאָן פֿלאָרעסענס לייפֿסצײַט בילדגעבונג מיקראָסקאָפּיע (FLIM) אין אַקוטע מוח סלייסיז פֿון 7-וואָכן-אַלט Mfn2cKO אָדער קאָנטראָל ליטערמייטס כּדי צו דעטעקטירן פּאָטענציעלע ענדערונגען אין ציטאָפּלאַזמישן רעדאָקס סטאַטוס נאָך וועריפֿיצירן FLIM באַדינגונגען (פֿיגור S8, E ביז G). די אַנאַליז האָט געוויזן אַ באַדײַטנדיקע פֿאַרגרעסערונג אין דעם אָקסידאַציע צושטאַנד פֿון אַ איין Mfn2cKO PNs אָן PCx אויסדרוק, וואָס איז אַנדערש פֿון קאָנטראָל נעוראָנען אָדער Mfn2cKO PNs וואָס אויסדריקן בלויז סקראַמבאַלד shRNA (פֿיגור 5, D און E). ווען PCx אויסדרוק איז געווען אַראָפּ-רעגולירט, איז דער פּראָצענט פון Mfn2cKO PNs וואָס ווייַזן אַ העכסט אַקסאַדייזד צושטאַנד געשטיגן מיט מער ווי דריי מאָל (פיגור 5E), וואָס ווייַזט אַז PCx אַרויף-רעגולאַציע האט אויפגעהאלטן די רעדאָקס קאַפּאַציטעט פון דעגענערירטע נעוראָנען.
(א) א סכעמע וואס ווייזט דעם עקספערימענטאלן פלאן פארן אינדזשעקטירן AAV קאדירנדיק shPCx ווען דער אנגעצייכנטער מעטאבאלישער וועג איז אקטיוויזירט. (ב) רעפרעזענטאטיווע קאנפאקאלע פאטאגראפיעס פון 8-וואכן-אלטע צערעבעלארע סעקשאַנז אין Mfn2cKO מײַז טראנסדוסירט און באצייכנט מיט אנטי-קאלסינעורין אנטיקערפער ביי 4 וואָכן. סקאַלע באַר, 450μm. (C) קוואַנטיפיקאַציע פון ​​פּורקינדזשע צעל געדיכטקייט אין AAV-טראנסדוסירטע שלייפן (איין-וועג אַנאַליז פון וואַריאַנס; n = 3 צו 4 מײַז). דאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי מיטל±SEM; ***P<0.001. (D) רעפרעזענטאטיווע FLIM בילד ווייזט די דורכשניטלעכע לעבן שפּאַן פון 7-וואכן-אלטע PN אויסדריקן גלוטאַטהיאָן רעדאָקס סענסאָר Grx1-roGFP2 אונטער די ספּעציפֿיצירטע עקספּערימענטאַלע באדינגונגען. LUT (לוק-אַפּ טיש) פאַרהעלטעניש: ניצל צייט אינטערוואַל (אין פּיקאָסעקונדעס). סקאַלע באַר, 25μm. (E) די היסטאָגראַם ווייזט די פאַרשפּרייטונג פון Grx1-roGFP2 לעבנס-צייט ווערטן פון (D) (n=158 ביז 368 צעלן אין צוויי מײַז אונטער יעדער באַדינגונג). די פּיראָג טשאַרט איבער יעדן היסטאָגראַם: ווייזט די צאָל צעלן מיט באַדײַטנד לענגערע (רויט, אָקסידירט) אָדער קירצערע (בלוי, רעדוצירט) לעבנס-צייט ווערטן, וואָס יקסיד 1 SD פון די דורכשניטלעכע לעבנס-צייט ווערט אין CTRL-AAV-scr. (F) די פארגעשלאגענע מאָדעל ווייזט די פּראַטעקטיוו ווירקונג פון אַפּרעגולאַציע פון ​​נעוראָנאַל PCx.
אין גאַנצן, די דאַטן וואָס מיר צושטעלן דאָ ווייַזן אַז די ווידער-עקספּרעסיע פון ​​MFN2 קען גאָר ראַטעווען אַוואַנסירטע PN מיט שווערע OXPHOS דיפישאַנסי, שווערע mtDNA דיפּלישאַן, און גאָר אַבנאָרמאַל יסטאַ-ווי מאָרפאָלאָגיע, דערמיט צושטעלן קאַנטיניואַס פּראָגרעס אפילו אין אַוואַנסירטע חולאתן. נעוראָדעגענעריישאַן גיט ריווערסאַבאַל באַווייַזן פון די בינע איידער צעל טויט. דעם גראַד פון מעטאַבאַליק בייגיקייט איז ווייַטער באַטאָנט דורך די פיייקייַט פון נעוראָנס צו ינדוצירן אַטעראָוסקלעראָוסיס (אַ ריוויירינג פון די TCA ציקל), וואָס ינכיבאַץ PCx אויסדרוק אין PNs פעלנדיק OXPHOS און ענכאַנסט צעל טויט, דערמיט פּלייינג אַ פּראַטעקטיוו ראָלע (פיגור 5F).
אין דעם שטודיע, האָבן מיר צוגעשטעלט באַווייזן אַז די רעאַקציע פון ​​פּ.נ.ס. צו אָקספאָס דיספֿונקציע איז צו ביסלעכווייַז קאָנווערדזשירן צו ט.ק.אַ. ציקל אַטעראָסקלעראָוסיס דורך די דיפערענציעלע אַקטיוואַציע פּאַטוויי אַקטיווירט דורך מעטאַבאַליק פּראָגראַמען. מיר האָבן באַשטעטיקט די פּראָטעאָמיק אַנאַליז מיט פילע קאָמפּלעמענטאַרי מעטאָדן און גילוי אַז ווען טשאַלאַנדזשד דורך שטרענג מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע, האָבן נעוראָנס אַ פריער אומבאַקאַנט פאָרעם פון מעטאַבאַליק עלאַסטיסיטי. צו אונדזער יבערראַשן, דער גאנצער ריוויירינג פּראָצעס טוט נישט דאַווקע מאַרקירן דעם טערמינאַל מעטאַבאַליק שטאַט וואָס באַגלייט נעוראָדעגענעריישאַן ביסלעכווייַז און יריווערסאַבלי, אָבער אונדזער דאַטן סאַגדזשעסץ אַז עס קען קאַנסטאַטוט אַ וישאַלט נעוראָן אפילו אין דער בינע איידער צעל טויט פאַנגקשאַנאַל קאָמפּענסאַציע מעקאַניזאַם. דעם דערפינדונג ינדיקייץ אַז נעוראָנס האָבן אַ באַטייטיק גראַד פון מעטאַבאַליק פּלאַסטיסיטי אין דעם גוף. דעם פאַקט באַווייַזן אַז די שפּעטער ריינטראַדאַקשאַן פון MFN2 קענען פאַרקערט די אויסדרוק פון שליסל מעטאַבאַליק מאַרקערס און פאַרמייַדן פּ.נ. דעגענעריישאַן. אויף די פאַרקערט, עס ינכיבאַץ אַטעראָסקלעראָוסיס און אַקסעלערייץ נערוועס. טראַנססעקסואַל.
איינע פון ​​די מערסט פאַסצינירנדיקע געפינסן אין אונדזער פאָרשונג איז אַז פּ.נ.ס וואָס פעלן אָקספאָס קענען מאָדיפיצירן דעם ט.ק.אַ. ציקל מעטאַבאָליזם דורך אַפּ-רעגולירן ענזימען וואָס ספּעציפֿיש סטימולירן אַרטעריאָסקלעראָזיס. מעטאַבאָלישע ריעריינדזשמענט איז אַ געוויינטלעכע שטריך פון ראַק סעלז, עטלעכע פון ​​וועלכע פאַרלאָזן זיך אויף גלוטאַמין צו סופּפּלעמענטירן ט.ק.אַ. ציקל ינטערמידייץ צו פּראָדוצירן רידוסינג עקוויוואַלענטן, וואָס טרייבן די רעספּעראַטאָרי קייט און האַלטן די פּראָדוקציע פון ​​ליפּיד און נוקלעאָטיד ביאָסינטעז פּרעקורסאָרס (39, 40). אַ פרישע שטודיע האט געוויזן אַז אין פּעריפעראַל געוועבן וואָס דערפאַרן אָקספאָס דיספונקציע, די ריקאַנעקשאַן פון גלוטאַמין/גלוטאַמאַט מעטאַבאָליזם איז אויך אַ פּראָמינענט שטריך (5, 41), וווּ די ריכטונג פון גלוטאַמין אַרייַנטרעטן אין די ט.ק.אַ. ציקל דעפּענדס אויף ווייַל פון די שטרענגקייט פון אָקספאָס שאָדן (41). אָבער, עס איז אַ מאַנגל פון קלאָרע זאָגן אויף קיין ענלעכקייט פון נעוראָנאַל מעטאַבאָליש פּלאַסטיסיטי אין דעם גוף און זיין מעגלעך רעלאַוואַנס אין די קראַנקייט קאָנטעקסט. אין אַ פרישע אין וויטראָ שטודיע, ערשטיק קאָרטיקאַל נעוראָנס זענען געוויזן צו מאָביליזירן גלוטאַמאַט פּאָאָלס פֿאַר נעוראָטראַנסמישאַן, דערמיט פּראַמאָוטינג אָקסידאַטיוו מעטאַבאָליזם און אַטעראָסקלעראָז אונטער מעטאַבאָליש דרוק באדינגונגען (42). עס איז ווערט צו באַמערקן אַז אונטער דער פאַרמאַקאָלאָגישער אינהיביציע פון ​​דעם TCA ציקל ענזיים סוקסינאַט דעהידראָגענאַזע, ווערט געגלויבט אַז פּירווואַט קאַרבאָקסילאַציע אויפהאַלט די סינטעז פון אָקסאַלאָאַסעטאַט אין קולטורירטע סערעבעלאַרע גראַניאַל נעוראָנען (34). אָבער, די פיזיאָלאָגישע באַטייַט פון די מעכאַניזמען צו מוח געוועב (וואו מען גלויבט אַז אַטעראָסקלעראָוסיס איז דער הויפּט באַגרענעצט צו אַסטראָסיטעס) האט נאָך וויכטיקע פיזיאָלאָגישע באַדייַטונג (43). אין דעם פאַל, אונדזער דאַטן ווייַזן אַז PNs געשעדיגט דורך OXPHOS אין דעם גוף קענען זיין סוויטשט צו BCAA דעגראַדאַציע און פּירווואַט קאַרבאָקסילאַציע, וואָס זענען די צוויי הויפּט קוואלן פון סופּפּלעמענטאַטיאָן פון TCA פּול ינטערמידייץ. כאָטש דער פּוטאַטיוו בייַשטייַער פון BCAA קאַטאַבאָליזם צו נעוראָנאַל ענערגיע מעטאַבאָליזאַם איז געווען פארגעלייגט, אין אַדישאַן צו דער ראָלע פון ​​גלוטאַמאַט און GABA פֿאַר נעוראָטראַנסמישאַן (44), איז נאָך קיין באַווייַזן פֿאַר די מעכאַניזמען אין וויוואָ. דעריבער, איז עס גרינג צו ספּעקולירן אַז דיספונקציאָנעלע PNs קענען אויטאָמאַטיש קאָמפּענסירן פֿאַר די קאַנסאַמשאַן פון TCA ינטערמידייץ געטריבן דורך דעם אַסימילאַציע פּראָצעס דורך ינקריסינג אַטעראָסקלעראָוסיס. באַזונדער, קען מען דאַרפֿן אַרויפֿרעגולאַציע פֿון PCx כּדי צו האַלטן אַן ערהויכטע נאָכפֿראַגע פֿאַר אַספּאַרטיק זויער, וואָס ווערט פֿאָרגעלייגט אין פּראָליפֿערירנדיקע צעלן מיט מיטאָטשאָנדריאַלער דיספֿונקציע (45). אָבער, אונדזער מעטאַבאָלאָמיקס אַנאַליז האָט נישט געוויזן קיין באַדײַטנדיקע ענדערונגען אין דעם סטאַבילן לעוועל פֿון אַספּאַרטיק זויער אין Mfn2cKO PNs (פֿיגור S6A), וואָס שפּיגלט מסתּמא אָפּ די פֿאַרשידענע מעטאַבאָלישע נוצן פֿון אַספּאַרטיק זויער צווישן פּראָליפֿערירנדיקע צעלן און פּאָסט-מיטאָטישע נעוראָנען. כאָטש דער גענויער מעכאַניזם פֿון PCx אַרויפֿרעגולאַציע אין דיספֿונקציאָנעלע נעוראָנען אין וויוואָ בלייבט נאָך צו כאַראַקטעריזירן, האָבן מיר דעמאָנסטרירט אַז די פֿריצײַטיקע רעאַקציע שפּילט אַ וויכטיקע ראָלע אין האַלטן דעם רעדאָקס צושטאַנד פֿון נעוראָנען, וואָס איז דעמאָנסטרירט געוואָרן אין FLIM עקספּערימענטן אויף סערעבעלאַרע סלייסיז. באַזונדער, קען פֿאַרהיטן PNs פֿון אַרויפֿרעגולירן PCx פֿירן צו אַ מער אָקסידירטן צושטאַנד און פֿאַרגיכערן צעל טויט. די אַקטיוואַציע פֿון BCAA דעגראַדאַציע און די קאַרבאָקסילאַציע פֿון פּירווואַט זענען נישט וועגן צו כאַראַקטעריזירן די פּעריפֿערישע געוועבן פֿון מיטאָטשאָנדריאַלער דיספֿונקציע (7). דעריבער, זיי שיינען צו זיין אַ פּריאָריטעט שטריך פון OXPHOS-דעפיציענט נעוראָנס, אפילו אויב נישט די איינציקע שטריך, וואָס איז וויכטיק פֿאַר נעוראָדעגענעראַציע.
סערעבעלאַרע קראַנקייט איז אַ העטעראָגענע טיפּ פון נעוראָדעגענעראַטיוו קראַנקייט וואָס מאַניפעסטירט זיך געוויינטלעך ווי אַטאַקסיאַ און אָפט שאַטן פּ.נ.ס. (46). די נעוראָן באַפעלקערונג איז באַזונדערס שפּירעוודיק צו מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע ווייַל זייער סעלעקטיוו דעגענעריישאַן אין מײַז איז גענוג צו רעפּראָדוצירן פילע פון ​​די מאָטאָר סימפּטאָמס וואָס כאַראַקטערייזירן מענטש ספּינאָסערעבעלאַרע אַטאַקסיאַ (16, 47, 48). לויט באַריכטן, אַ טראַנסגעניק מויז מאָדעל מיט אַ מוטאַנט דזשין איז פֿאַרבונדן מיט מענטש ספּינאָסערעבעלאַרע אַטאַקסיאַ און האט מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע (49, 50), וואָס אונטערשטרייכט די וויכטיקייט פון שטודירן די קאַנסאַקווענסאַז פון OXPHOS דיפישאַנסי אין פּ.נ.פ.ה.. דעריבער, איז עס באַזונדערס פּאַסיק צו עפעקטיוו אפגעזונדערן און שטודירן די יינציק נעוראָן באַפעלקערונג. אָבער, געגעבן אַז פּ.נ.ס. זענען זייער סענסיטיוו צו דרוק און אַקאַונט פֿאַר אַ נידעריק פּראָפּאָרציע פון ​​​​די גאנצע סערעבעלאַרע צעל באַפעלקערונג, פֿאַר פילע אָמיקס-באזירט שטודיעס, סעלעקטיוו סעפּאַראַטיאָן פון זיי ווי גאַנצע סעלז איז נאָך אַ טשאַלאַנדזשינג אַספּעקט. כאָטש עס איז כּמעט אוממעגלעך צו דערגרייכן אַ אַבסאָלוטן מאַנגל פון קאָנטאַמינאַציע פון ​​אַנדערע צעל טיפּן (ספּעציעל דערוואַקסענע געוועבן), האָבן מיר קאָמבינירט אַן עפעקטיוון דיסאָסיאַציע שריט מיט FACS צו באַקומען אַ גענוגיקע צאָל לעבנספֿעיִקע נעוראָנען פֿאַר דאַונסטרים פּראָטעאָמיקס אַנאַליז, און האָבן אַ גאַנץ הויכע פּראָטעין קאַווערידזש (וועגן 3000 פּראָטעאינען) קאַמפּערד מיט די עקסיסטירנדיקע דאַטן סעט פון די גאַנצע סערעבעללום (51). דורך פּרעזערווירן די לעבנספֿעיִקייט פון גאַנצע צעלן, דער מעטאָד וואָס מיר צושטעלן דאָ דערלויבט אונדז ניט בלויז צו קאָנטראָלירן די ענדערונגען אין די מעטאַבאַליק פּאַטווייז אין די מיטאָטשאָנדריאַ, אָבער אויך צו קאָנטראָלירן די ענדערונגען אין זייַן ציטאָפּלאַזמיש קאַונערפּאַרץ, וואָס קאַמפּלעמענטירט די נוצן פון מיטאָטשאָנדריאַל מעמבראַן טאַגס צו באַרייַכערן צעל טיפּ די נייַע מעטאָד פֿאַר די צאָל פון מיטאָטשאָנדריאַ אין קאָמפּלעקס געוועבן (52, 53). די מעטאָד וואָס מיר באַשרייַבן איז ניט בלויז פֿאַרבונדן מיט די שטודיע פון ​​פּורקינדזשע צעלן, אָבער קען לייכט ווערן געווענדט צו קיין טיפּ פון צעל צו אַדרעסירן מעטאַבאַליק ענדערונגען אין קראַנק מוחות, אַרייַנגערעכנט אַנדערע מאָדעלס פון מיטאָטשאָנדריאַל דיספֿונקציע.
צום סוף, האָבן מיר אידענטיפיצירט אַ טעראַפּעווטיש פֿענצטער בעת דעם מעטאַבאַלישן רעאָרגאַניזאַציע פּראָצעס וואָס קען גאָר איבערקערן די שליסל סימנים פון צעלולאַרן דרוק און פאַרהיטן נעוראָנאַל דעגענעראַציע. דעריבער, פֿאַרשטיין די פאַנגקשאַנאַלע ימפּלאַקיישאַנז פון די רעוויירינג באַשריבן דאָ קען צושטעלן יסודותדיקע ינסייץ אין מעגלעכע באַהאַנדלונגען פֿאַר מיינטיינינג נעוראָנאַל ווייאַבילאַטי בעת מיטאָטשאָנדריאַל דיספונקציע. צוקונפֿטיקע פאָרשונג אַימעד צו דיסעקטינג ענדערונגען אין ענערגיע מעטאַבאָליזאַם אין אנדערע מאַרך צעל טייפּס איז דארף צו גאָר אַנטדעקן די אַפּליקאַביליטי פון דעם פּרינציפּ צו אנדערע נעוראָלאָגישע חולאתן.
מיטאָפּאַרק מײַז זענען שוין פריער באַשריבן געוואָרן (31). C57BL/6N מײַז מיט לאָקסP פֿלאַנקירנדיקע Mfn2 גענעס זענען שוין פריער באַשריבן געוואָרן (18) און געקראָסט מיט L7-Cre מײַז (23). די רעזולטאַט טאָפּל העטעראָזיגאָוס נאָכקומען זענען דעמאָלט געקראָסט געוואָרן מיט כאָומאָזיגאָוס Mfn2loxP/Mfn2loxP מײַז צו דזשענערירן פּורקינדזשע-ספּעציפֿישע גענע נאַקאַוטס פֿאַר Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). אין אַ סאַבסעט פון פּאָרינג, די Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP אַלעל (stop-mtYFP) איז געווען ינטראָודוסט דורך נאָך קראָסינגס (20). אַלע כייַע פּראָצעדורן זענען דורכגעפֿירט געוואָרן אין לויט מיט אייראָפּעיִשע, נאַציאָנאַלע און אינסטיטוציאָנעלע גיידליינז און באוויליקט דורך לאַנדעזאַמטפֿירנאַטור פון אומוועלט און פֿאַרבראַוכערשוץ, נאָרד ריין-וועסטפֿאַליע, דײַטשלאַנד. כייַע אַרבעט אויך פֿאָלגט די גיידליינז פון די אייראָפּעיִשע פֿעדעראַציע פון ​​לאַבאָראַטאָריע כייַע וויסנשאַפֿטן אַסאָוסייישאַנז.
נאך אנעסטעזירן די שוואנגערישע פרוי'ס צוואַנק-דיסלאָקאַציע, ווערט דער מויז עמבריאָ אפגעזונדערט (E13). די קאָרטעקס איז דיסעקטירט געוואָרן אין הענקס' באַלאַנסירטע זאַלץ לייזונג (HBSS) סופּלעמענטירט מיט 10 mM Hepes און איבערגעגעבן אויף Dulbecco's Modified Eagle's Medium וואָס ענטהאַלט פּאַפּאַין (20 U/ml) און ציסטאין (1μg/ml). אינקובירט דאָס געוועב אין DMEM) און דיסאָוסיאַטירט עס דורך ענזימאַטישע דיידזשעסטשאַן. Ml) ביי 37°C פֿאַר 20 מינוט, און דערנאָך מעכאַניש געמאָלן אין DMEM סופּלעמענטירט מיט 10% פעטאַל רינדער סערום. צעלן זענען געזייט געוואָרן אויף גלאָז דעקל-סליפּס באדעקט מיט פּאָליליזין מיט אַ געדיכטקייט פון 2×106 פּער 6 סענטימעטער קולטור שיסל אָדער מיט אַ געדיכטקייט פון 0.5×105 צעלן/cm2 פֿאַר בילד-אַנאַליז. נאָך 4 שעה, איז דער מעדיום ריפּלייסט געוואָרן מיט נעוראָבאַסאַל סערום-פֿרייַ מעדיום וואָס ענטהאַלט 1% B27 סופּלעמענט און 0.5 mM GlutaMax. די נעוראָנען זענען דעמאָלט געהאַלטן געוואָרן ביי 37°C און 5% CO2 איבערן גאַנצן עקספּערימענט, און געגעבן עסן איין מאָל אַ וואָך. כּדי צו פאַראורזאַכן רעקאָמבינאַציע אין וויטראָ, איז 3μl (24-וועלל קולטור שיסל) אָדער 0.5μl (24-וועלל פּלאַטע) פון דעם פאָלגנדיקן AAV9 ווירוס וועקטאָר געניצט געוואָרן צו באַהאַנדלען נעוראָנען אויפן צווייטן טאָג אין וויטראָ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, קאַטאַלאָג נומער 105530-AAV9) און AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, קאַטאַלאָג נומער 105545-AAV9).
מויז Mfn1 און Mfn2 קאמפלעמענטארע DNA (באקומען פון Addgene פּלאַזמיד #23212 און #23213, ריספּעקטיוולי) זענען געצייכנט מיט די V5 סיקוואַנס (GKPIPNPLLGLDST) ביים C-טערמינוס, און זענען צוזאַמענגעפֿאַסן מיט mCherry אין ראַם דורך די T2A סיקוואַנס. Grx1-roGFP2 איז אַ מתּנה פֿון Heidelberg TP Dick DFKZ (דײַטשע קרעבספֿאָרשונגסצענטרום). דורך פֿאַרבײַטן די tdTomato קאַסעטע מיט קאַנווענשאַנעלע קלאָונינג מעטאָדן, איז די קאַסעטע סובקלאָנירט געוואָרן אין די pAAV-CAG-FLEX-tdTomato באַקבאָון (Addgene רעפֿערענץ נומער 28306) צו שאַפֿן pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 און pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 וועקטאָרן. א ענלעכע סטראַטעגיע איז גענוצט געוואָרן צו שאַפֿן דעם קאָנטראָל וועקטאָר pAAV-CAG-FLEX-mCherry. כּדי צו שאַפֿן דעם AAV-shPCx קאָנסטרוקט, איז נויטיק אַ פּלאַזמיד AAV וועקטאָר (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), וואָס כּולל די DNA סיקוואַנס וואָס קאָדירט די shRNA וואָס צילט מויז PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGACGAAAG 3′). אונטער דער קאָנטראָל פֿון דעם U6 פּראָמאָטער, ווערט mCherry גענוצט אונטער דער קאָנטראָל פֿון דעם CMV פּראָמאָטער. די פּראָדוקציע פֿון הילפֿס-AAV וועקטאָרן איז דורכגעפֿירט געוואָרן לויט די אינסטרוקציעס פֿונעם פאַבריקאַנט (Cell Biolabs). קורץ געזאגט, ניצט א טראנספער פלאזמיד וואס טראגט mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) טראַנזיטאָריש. טראַנספעקשאַן פון 293AAV צעלן-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) אדער Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) קאָדירנדיקן גען, ווי אויך קאָדירנדיק AAV1 קאַפּסיד פּראָטעין און אַקסעסאָרי פּראָטעין. פּאַקקאַגינג פלאזמיד פלאזמיד, ניצנדיק קאַלסיום פאָספֿאַט מעטאָד. דער רויער ווירוס סופּערנאַטאַנט איז באַקומען געוואָרן דורך פרירן-אויטאָ ציקלען אין אַ טרוקן אייז/עטאַנאָל וואַנע און ליזירט צעלן אין פאָספֿאַט באַפֿערד סאַלין (PBS). דער AAV וועקטאָר איז גערייניקט געוואָרן דורך נישט-קאָנטינויִערלעכע יאָדיקסאַנאָל גראַדיענט אולטראַצענטריפוגאַציע (24 שעה ביי 32,000 רפּם און 4°C) און קאָנצענטרירט מיט אַן Amicon אולטראַ-15 צענטריפוגאַל פילטער. גענאָם טיטער פון AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 גענאָם קאָפּיע (GC)/מל], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/מל), AAV1-CAG-FLEX איז געווען ווי פריער באַשריבן (54), געמאָסטן דורך רעאַל-צייט קוואַנטיטאַטיווע PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/מל) און AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/מל).
פריימערי נעוראָנען זענען אָפּגעקראַצט געוואָרן אין אייז-קאַלטן 1x PBS, צוזאַמענגעשטעלט אין פּעלעטן, און דערנאָך האָמאָגעניזירט אין 0.5% טריטאָן X-100 / 0.5% נאַטריום דעאָקסיטשאָלאַט/PBS ליזיס באַפער מיט פאָספאַטאַז און פּראָטעאַזע אינהיביטאָר (ראָש). פּראָטעין קוואַנטיפיקאַציע איז דורכגעפירט געוואָרן דורך ניצן די ביסינטשאָניניק זויער אַסיי (טהערמאָ פישער סייענטיפיק). די פּראָטעאינען זענען דערנאָך אפגעשיידט געוואָרן דורך SDS-פּאָליאַקרילאַמיד געל עלעקטראָפאָרעזיס, און דערנאָך בלאָטט אויף אַ פּאָליווינילידען פלאָריד מעמבראַנע (GE Healthcare). בלאָקירט נישט-ספּעציפֿישע זייטלעך און אינקובירט מיטן פריימערי אַנטיבאָדי (זעט טאַבעלע S1 פֿאַר פרטים) אין 5% מילך אין TBST (טריס-באַפערד סאַלין מיט Tween), וואַשינג סטעפּס און צווייטיק אַנטיבאָדי אין TBST Incubate. אינקובירט מיטן פריימערי אַנטיבאָדי איבער נאַכט ביי +4°C. נאָך וואַשן, לייגט אויף דעם צווייטיקן אַנטיבאָדי פֿאַר 2 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור. דערנאָך, דורך אינקובירן דעם זעלבן בלאָט מיט אַן אַנטי-β-אַקטין אַנטיבאָדי, איז די זעלבע לאָודינג באַשטעטיקט געוואָרן. דעטעקציע דורך קאָנווערטירן צו כעמילומינאַסענס און פֿאַרשטאַרקן כעמילומינאַסענס (GE העלטקער).
די נעוראָנען וואָס זענען פריער געזייט געוואָרן אויף גלאָז דעקל-גלעזלעך זענען פיקסירט געוואָרן מיט 4% פּאַראַפאָרמאַלדעכייד (PFA)/PBS אין דער באַשטימטער צייט-פונקט ביי צימער-טעמפּעראַטור פֿאַר 10 מינוט. די דעקל-גלעזלעך זענען ערשט דורכגעדרונגען מיט 0.1% טריטאָן X-100/PBS פֿאַר 5 מינוט ביי צימער-טעמפּעראַטור, און דערנאָך אין בלאָקירנדיקן באַפער [3% רינדער סערום אַלבומין (BSA)/PBS]. אויפן צווייטן טאָג זענען די דעקל-גלעזלעך געוואַשן געוואָרן מיט בלאָקירנדיקן באַפער און אינקובירט געוואָרן מיטן פּאַסיקן פלאָראָפאָר-קאָניוגירטן צווייטיקן אַנטיבאָדי פֿאַר 2 שעה ביי צימער-טעמפּעראַטור; צום סוף זענען די מוסטערן גוט געוואַשן געוואָרן אין PBS מיט 4′,6-דיאַמידינאָ-2-פֿענילינדאָל (DAPI) וואָס איז קאַונטערגעפֿאַרבט געוואָרן און דערנאָך פיקסירט אויפן מיקראָסקאָפּ-גלעכל מיט אַקוואַ-פּאָלי/מאָונט.
מײַז (זכר און נקבה) זענען אַנעסטעזירט געוואָרן דורך אַן אינטראַפּעריטאָנעאַלע אינדזשעקציע פון ​​קעטאַמין (130 מג/קג) און קסילאַזין (10 מג/קג) און געגעבן סובקוטאַנעאָוסלי מיט קאַרפּראָפען אַנאַלגעטיק (5 מג/קג), און געשטעלט אין אַ סטערעאָטאַקטישן אינסטרומענט (קאָפּף) אויסגעשטאַט מיט אַ וואַרעם פּאַד. ענטפּלעקט דעם שאַרבן און ניצט אַ דענטאַל דריל צו דין מאַכן דעם טייל פון די סערעבעלאַר קאָרטעקס וואָס קאָרעספּאָנדירט צו די מיס ביין (פון לאַמבדאַ: עק 1.8, לאַטעראַל 1, קאָרעספּאָנדירנדיק צו לאָבולעס IV און V). ניצט אַ געבויגענע שפּריץ נאָדל צו פֿאָרזיכטיק שאַפֿן אַ קליין לאָך אין די שאַרבן צו ויסמיידן דיסראַפּטינג די וואַסקולאַטור אונטן. דערנאָך ווערט די דין געצויגענע גלאָז קאַפּילאַר פּאַמעלעך אַרײַנגעשטעלט אין די מיקראָ-לאָך (פון -1.3 צו -1 אויף די ווענטראַלע זײַט פון די דוראַ מאַטער), און 200 ביז 300 נול AAV ווערט אינדזשעקטירט אין די מיקראָ-אינדזשעקטאָר (נאַרישיגע) מיט מאַנועלע שפּריץ (נאַרישיגע) עטלעכע מאָל בײַ נידעריקן דרוק איבער אַ צײַט-פּעריאָד פון 10 ביז 20 מינוט פֿענצטער. נאך דער אינפוזיע, לייגט די קאפילאר פאר נאך 10 מינוט כדי דער ווירוס זאל זיך אינגאנצן פארשפרייטן. נאכדעם וואס די קאפילארן ווערן ארויסגענומען, ווערט די הויט פארזיכטיק צוזאמענגענייט כדי צו מינימיזירן וואונד-אנטצינדונג און דערלויבן דעם בעל-חי זיך צו ערהוילן. די בעלי-חיים זענען באהאנדלט געווארן מיט אנסטיקערס (קאספאפען) פאר עטליכע טעג נאך דער אפעראציע, בעת וועלכער צייט איז זייער פיזישער צושטאנד קערפול באאבאכטעט געווארן און דערנאך זענען זיי אומגעברענגט געווארן אין דער באשטימטער צייט-פונקט. אלע פראצעדורן זענען דורכגעפירט געווארן לויט אייראפעאישע, נאציאנאלע און אינסטיטוציאנעלע גיידליינז און זענען באשטעטיגט געווארן דורך לאַנדעזאַמטפירנאַטור פון אומוועלט און פארבראַוכערשוץ, נאָרדריין-וועסטפאליע, דייטשלאנד.
די חיות זענען אנעסטעזירט געוואָרן מיט קעטאַמין (100 מג/קג) און קסילאַזין (10 מג/קג), און דאָס האַרץ איז ערשט דורכגעפֿירט געוואָרן מיט 0.1 M PBS, און דערנאָך מיט 4% PFA אין PBS. דאָס געוועב איז דיסעקטירט און פֿיקסירט געוואָרן אין 4% PFA/PBS איבער נאַכט ביי 4°C. אַ וויברירנדיק מעסער (Leica Microsystems GmbH, ווין, עסטרייך) איז געניצט געוואָרן צו צוגרייטן סאַגיטאַלע סעקשאַנז (50 מיקראָמעטער דיק) פֿון דעם פֿיקסירטן מוח אין PBS. סיידן אַנדערש ספּעציפֿיצירט, איז די פֿרײַ-שוועבנדיקע סעקשאַנז דורכגעפֿירט געוואָרן ווי באַשריבן אויבן (13) ביי צימער טעמפּעראַטור און מישן. אין קורצן, ערשט, זענען די באַקומענע סלייסעס דורכגעפֿירט געוואָרן מיט 0.5% Triton X-100/PBS פֿאַר 15 מינוט ביי צימער טעמפּעראַטור; פֿאַר עטלעכע עפּיטאָפּן (Pcx און Shmt2), דורך אין טריס-EDTA באַפֿער ביי 80°C (PH 9) וואַרעמען די סלייסעס פֿאַר 25 מינוט אַנשטאָט דעם שריט. דערנאך, די סעקציעס זענען אינקובירט געווארן מיט ערשטיקן אנטיקערפער (זעה טאבעלע S1) אין בלאקירנדיקן באַפער (3% BSA/PBS) ביי 4°C איבערנאכט מיט מישן. דעם נעקסטן טאג, די סעקציעס זענען געוואשן געווארן מיט בלאקירנדיקן באַפער און אינקובירט מיט דעם צוגעפאסטן פלואָראָפאָר-קאָנדזשוגירטן צווייטן אנטיקערפער פאר 2 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור; צום סוף, די סעקציעס זענען גרינטלעך געוואשן געווארן אין PBS, קאנטער-געפארבט מיט DAPI, און דערנאך פיקסירט מיט AquaPolymount אויף א מיקראסקאפ סלייד.
א לאַזער סקאַנינג קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ (TCS SP8-X אדער TCS דידזשאַטאַל לייט שיט, לייקאַ מיקראָסיסטעמס) אויסגעשטאַט מיט אַ ווייס ליכט לאַזער און אַ 405 דיאָד אולטראַוויאָלעט לאַזער איז געניצט געוואָרן צו בילדגעבן דעם מוסטער. דורך עקסייטירן דעם פלאָראָפאָר און זאַמלען דעם סיגנאַל מיט כייבריד דעטעקטאָר (HyDs), איז LAS-X ווייכווארג געניצט געוואָרן צו זאַמלען סטאַקט בילדער וואָס קאָנפאָרמירן צו נייקוויסט סאַמפּלינג אין סיקווענטשאַל מאָדע: פֿאַר ניט-קוואַנטיטאַטיווע פּאַנאַלז, איז עס העכסט דינאַמיש סיגנאַלן (למשל, אין סאָמאַטיש סעלז און דענדריטן) mtYFP) ניצט HyD צו דעטעקטירן די נומער פון PNs אין ברייטR מאָדע). גייטינג פון 0.3 צו 6 ns איז געווענדט צו רעדוצירן הינטערגרונט.
רעאַל-צייט בילדגעבונג פון סאָרטירטע צעלן. נאָך סאָרטירן אין נעוראָבאַסאַל-A מעדיום מיט 1% B27 סאַפּלאַמענט און 0.5 mM גלוטאַמאַקס, זענען די צעלן גלייך געזייט געוואָרן אויף פּאָלי-ל-ליזין-באדעקטע גלאָז סליידז (μ-Slide8 Well, Ibidi, קאַטאַלאָג נומער 80826), און דערנאָך געהאַלטן ביי 37°C און 5% CO2 פֿאַר 1 שעה צו לאָזן די צעלן זיך באַזעצן. רעאַל-צייט בילדגעבונג איז דורכגעפירט געוואָרן אויף אַ Leica SP8 לאַזער סקאַנינג קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ מיט אַ ווייסן לאַזער, HyD, 63×[1.4 נומערישע אַפּערטור (NA)] אויל אָביעקטיוו לינז און אַ הייצונג בינע.
די מויז איז שנעל אנעסטעזירט געווארן מיט קוילן דייאקסייד און אפגעשניטן געווארן פון איר קאפ, דער מוח איז שנעל ארויסגענומען געווארן פון דעם שאַרבן, און געשניטן אין 200μm דיק (פאר 13C לייבלינג עקספערימענט) אדער 275μm דיק (פאר צוויי פאטאן עקספערימענטן) סאגיטאלע סעקציע געפילט מיט די פאלגנדע מאטעריאלן. די אייז קרעם (HM-650 V, טערמא פישער סייענטיפיק, וואלדארף, דייטשלאנד) איז געפילט מיט די פאלגנדע סובסטאנצן: 125 mM אייז-קאלט, קוילן-געזעטיקט (95% O2 און 5% CO2) נידריג Ca2 + קינסטלעכע צערעבראספינאלע פליסיקייט (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נאטריום פאספאט באַפער, 25 mM NaHCO3, 25 mM גלוקאז, 0.5 mM CaCl2 און 3.5 mM MgCl2 (אסמאטישער דרוק פון 310 ביז 330 mmol). טראַנספערירט די באַקומענע מוח-שלייסעס צו אַ פאַר-אינקובאַציע קאַמער וואָס כּולל העכער Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נאַטריום פאָספֿאַט באַפֿער, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקאָז, 1.0 mM CaCl2 און 2.0 mM MgCl2) מעדיום) pH 7.4 און 310 ביז 320 mmol).
בעת דעם בילדגעבונג פּראָצעס, זענען די סלייסעס אריבערגעפירט געוואָרן אין אַ באַזונדערן בילדגעבונג צימער, און דער עקספּערימענט איז דורכגעפירט געוואָרן אונטער קאָנטינויִערלעכער ACSF פּערפוסיע ביי אַ קאָנסטאַנטער טעמפּעראַטור פון 32° ביז 33°C. אַ מולטיפאָטאָן לאַזער סקאַנינג מיקראָסקאָפּ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) אויסגעשטאַט מיט אַ Leica 25x אָביעקטיוו לינז (NA 0.95, וואַסער), Ti: Sapphire לאַזער (Chameleon Vision II, Coherent) איז גענוצט געוואָרן פֿאַר סלייסע בילדגעבונג. FLIM מאָדול (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM פון Grx1-roGFP2. די ענדערונגען אין דעם ציטאָפּלאַזמישן רעדאָקס צושטאַנד פון PNs זענען געמאָסטן געוואָרן דורך צוויי-פאָטאָן FLIM אין סאַגיטאַלע מוח-סלייסאַז, וואו דער Grx1-roGFP2 ביאָסענסאָר האָט געצילט PNs. אין דער PN שיכט, ווערט דער אַקוויזישאַן פעלד אויסגעקליבן בערך 50 ביז 80 מיקראָמעטער אונטער דער סלייס-איבערפלאַך צו זיכער מאַכן אַז עס איז דאָ אַ לעבנס-פעיִקער PN (דאָס הייסט, דער מאַנגל פון בעאַדעד סטרוקטור אָדער נעוראָנאַל מאָרפאָלאָגישע ענדערונגען צוזאמען די דענדריטן) און דער טאָפּלט פּאָזיטיווער roGFP2 סענסאָר און AAV קאָדירנדיקער shRNA PCx אָדער זיין קאָנטראָל סיקוואַנס (יעדער קאָ-אויסדריקנדיק mCherry). זאַמלען איין-סטאַק בילדער מיט 2x דיגיטאַלער זום [עקסיטאַציע כוואַליע-לענג: 890 נם; 512 נם 512 פּיקסעלס]. דעטעקציע: אינערלעכער HyD, פלאָרעסצעין איזאָטהיאָסיאַנאַט (FITC) פילטער גרופּע] און בילד-אַווריידזשינג אין 2 ביז 3 מינוט ווערן גענוצט צו זיכער מאַכן אַז גענוג פאָטאָנען ווערן געזאַמלט (1000 פאָטאָנען אין גאַנצן) פֿאַר קורווע פיטינג. די סענסיטיוויטי פון די Grx1-roGFP2 פּראָבע און די וועריפיקאַציע פון ​​FLIM באדינגונגען זענען דורכגעפירט געוואָרן דורך מאָניטאָרירן דעם לעבנס-צייט ווערט פון roGFP2 ווען מען לייגט צו עקסאָגענע 10 mM H2O2 צום פּערפוסיאָן ACSF (צו מאַקסאַמיזירן אַקסאַדיישאַן, וואָס רעזולטירט אין אַ פאַרלענגערטער לעבנס-צייט), און דערנאָך לייגט צו 2 mM דיטיאָטהרייטאָל (מינימיזירט דעם גראַד פון רעדוקציע, וואָס רעזולטירט אין אַ פאַרקלענערונג אין לעבנס-צייט) (פיגור S8, D ביז G). ניצט FLIMfit 5.1.1 ווייכווארג צו אַנאַליזירן די באַקומען רעזולטאַטן, צופּאַסן די איין עקספּאָנענציעלע פאַרפוילן קורווע פון ​​דעם גאַנצן בילד צו די געמאָסטענע IRF (אינסטרומענט ענטפער פונקציע), און χ2 איז אַפּראָקסימאַטלי 1. צו רעכענען די לעבנס-צייט פון אַן איין PN, איז די מאַסקע אַרום דעם נערוו גוף מאַנועל געצייכנט געוואָרן, און די דורכשניטלעכע לעבנס-צייט אין יעדער מאַסקע איז געניצט געוואָרן פֿאַר קוואַנטיפיקאַציע.
מיטאָטשאָנדריאַל פּאָטענציעל אַנאַליז. נאָכדעם וואָס די אַקוטע סעקציע איז געווען אינקובירט מיט 100 nM TMRM גלייך צוגעגעבן צו די פּערפיוזד ACSF פֿאַר 30 מינוט, די מיטאָטשאָנדריאַל פּאָטענציעל ענדערונגען פון PNs זענען געמאסטן דורך אַ צוויי-פאָטאָן מיקראָסקאָפּ. TMRM בילדגעבונג איז דורכגעפירט געוואָרן דורך עקסייטינג די פּראָבע ביי 920 nm און ניצן אינערלעכע HyD (טעטראַמעטהילראָדאַמין איזאָטהיאָסיאַנאַט: 585/40 nm) צו זאַמלען סיגנאַלן; דורך ניצן די זעלבע עקסייטיישאַן כוואַליע לענג אָבער ניצן אַן אַנדער אינערלעכע HyD (FITC :525/50) צו בילדגעבן mtYFP. ניצן ImageJ'ס Image Calculator פּלוג-אין צו אָפּשאַצן מיטאָטשאָנדריאַל פּאָטענציעל אויף די איין צעל מדרגה. אין קורץ, די פּלוג-אין גלייכונג: סיגנאַל = min (mtYFP, TMRM) איז געניצט צו ידענטיפיצירן די מיטאָטשאָנדריאַל געגנט וואָס ווייזט די TMRM סיגנאַל אין פּורקינדזשע סאָמאַלי אין די איין-סטאַק קאָנפאָקאַל בילד פון די קאָראַספּאַנדינג קאַנאַל. דערנאך ווערט די פּיקסעל שטח אין דער רעזולטאַט מאַסקע קוואַנטיפיצירט, און דערנאָך נאָרמאַליזירט אויף די קאָראַספּאַנדינג שוועל איין-סטאַק בילד פון די mtYFP קאַנאַל צו באַקומען די מיטאָטשאָנדריאַל פראַקציע וואָס ווייַזט די מיטאָטשאָנדריאַל פּאָטענציעל.
דאס בילד איז דעקאָנוואַלוטירט געוואָרן מיט Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) ווייכווארג. פֿאַר די סקאַנירטע בילדער פֿון פּליטקעס, ווערט די מאָנטאַזש פֿון אַן איינציקן פּליט געמאַכט מיטן אויטאָמאַטישן נייען אַלגעריטם פֿון LAS-X ווייכווארג. נאָך בילד קאַליבראַציע, ניצט ImageJ און Adobe Photoshop צו ווייטער פּראָצעסירן דאָס בילד און אייניג צופּאַסן די ברייטקייט און קאָנטראַסט. ניצט Adobe Illustrator פֿאַר גראַפֿישע צוגרייטונג.
mtDNA פאָקוס אַנאַליז. די צאָל פון mtDNA לעזשאַנז איז געווען קוואַנטיפיצירט אויף סערעבעללאַר סעקשאַנז לייבאַלד מיט אַנטיבאָדיעס קעגן DNA דורך קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ. יעדער ציל געגנט איז באשאפן פֿאַר די צעל גוף און די קערן פון יעדער צעל, און די ריספּעקטיוו געגנט איז קאַלקיאַלייטיד ניצן די Multi Measure פּלוגין (ImageJ ווייכווארג). סובטראַקט די קערן געגנט פון די צעל גוף געגנט צו באַקומען די ציטאָפּלאַזמיק געגנט. צום סוף, די Analyze Particles פּלוגין (ImageJ ווייכווארג) איז געניצט צו אויטאָמאַטיש קוואַנטיפיצירן די ציטאָפּלאַזמיק DNA פונקטן וואָס ווייַזן mtDNA אויף די שוועל בילד, און די באקומען רעזולטאַטן זענען נאָרמאַלייזד צו די PN דורכשניטלעך פון CTRL מײַז. די רעזולטאַטן זענען אויסגעדריקט ווי די דורכשניטלעך נומער פון נוקלעאָסידעס פּער צעל.
פּראָטעין אויסדרוק אַנאַליז. ניצט ImageJ'ס בילד קאַלקולאַטאָר פּלוג-אין צו עוואַלויִרן פּראָטעין אויסדרוק אין PN אויף דער איין-צעל מדרגה. אין קורצן, אין דעם איין-שיכטיקן קאָנפאָקאַל בילד פון דעם קאָרעספּאָנדירנדיקן קאַנאַל, דורך דער גלייכונג: סיגנאַל = מין (mtYFP, אַנטיבאָדי), ווערט דער מיטאָטשאָנדריאַלער געגנט וואָס ווייזט ימיונאָרעאַקטיוויטי צו אַ געוויסן אַנטיבאָדי אין פּורקינאַ אידענטיפיצירט. דערנאָך ווערט דער פּיקסעל געגנט אין דער רעזולטאַט מאַסקע קוואַנטיפיצירט, און דערנאָך נאָרמאַליזירט אויף דעם קאָרעספּאָנדירנדיקן שוועל איין-סטאַק בילד פון דעם mtYFP קאַנאַל צו באַקומען די מיטאָטשאָנדריאַלע פראַקציע פון ​​דעם געוויזן פּראָטעין.
פּורקינדזשע צעל געדיכטקייט אנאליז. דער סעל ציילער פּלוג-אין פון אימעדזשעי איז גענוצט געוואָרן צו עוואַלויִרן פּורקינדזשע געדיכטקייט דורך צעטיילן די צאָל פּורקינדזשע צעלן געציילט דורך דער לענג פון דעם סערעבעלאַרן רינג פאַרנומען דורך די געציילט צעלן.
מוסטער צוגרייטונג און זאַמלונג. די מוחות פון דער קאָנטראָל גרופּע און Mfn2cKO מײַז זענען פיקסירט געוואָרן אין 2% PFA/2.5% גלוטאַראַלדעהייד אין 0.1 M פאָספֿאַט באַפֿער (PB), און דערנאָך זענען קאָראָנאַלע סעקשאַנז צוגעגרייט געוואָרן מיט סיליאַטעס (Leica Mikrosysteme GmbH, ווין, עסטרייך) (דיקקייט 50 ביז 60 μm). דערנאָך פיקסירט אין PB באַפֿער אין 1% os טעטראַאָקסייד און 1.5% פּאָטאַסיום פֿעראָסיאַניד בײַ צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 1 שעה. די סעקשאַנז זענען געוואַשן געוואָרן דרײַ מאָל מיט דיסטילירט וואַסער, און דערנאָך געפֿאַרבט מיט 70% עטאַנאָל מיט 1% אוראַניל אַצעטאַט פֿאַר 20 מינוט. די סעקשאַנז זענען דערנאָך דעכידראַטירט געוואָרן אין גראַדירטן אַלקאָהאָל און איינגעבעטן אין דורקופאַן ACM (אַראַלדייט קאַסטינג רעזין M) עפּאָקסי רעזין (עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי סייאַנסעס, קאַטאַלאָג נומער 14040) צווישן סיליקאָן-באדעקטע גלאָז סליידז, און לעסאָף בײַ 60°C פּאָלימעריזירט אין אויוון פֿאַר 48 שעה. די צערעבעלאַרע קאָרטעקס געגנט איז אויסגעקליבן געוואָרן און 50 נאַנאָמעטער אולטראַ-דינע סעקשאַנז זענען געשניטן געוואָרן אויף Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, ווין, עסטרייך) און אויסגעקליבן אויף אַ 2×1 מם קופּער שפּאַלט גריד באדעקט מיט פּאָליסטירען פילם. די סעקשאַנז זענען געפֿאַרבט געוואָרן מיט אַ לייזונג פון 4% אוראַניל אַצעטאַט אין H2O פֿאַר 10 מינוט, געוואַשן מיט H2O עטלעכע מאָל, דערנאָך מיט Reynolds בליי ציטראַט אין H2O פֿאַר 10 מינוט, און דערנאָך געוואַשן מיט H2O עטלעכע מאָל. מיקראָגראַפֿן זענען גענומען געוואָרן מיט אַ טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּ Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ניצנדיק אַ TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 דיגיטאַלע קאַמעראַ (TVIPS GmbH, Gauting, USA). דייטשלאַנד).
פֿאַר מײַז וואָס זענען געווען אינפֿעקטירט מיט AAV, איז דער מוח געוואָרן אפגעטיילט און צעשניטן אין אַ 1 מ״מ דיק סאַגיטאַל סעקציע, און דער סערעבעללום איז געוואָרן אויסגעפֿאָרשט מיט אַ פֿלאָרעסענס מיקראָסקאָפּ צו אידענטיפֿיצירן דעם AAV-אינפֿעקטירטן רינג (ד״ה, mCherry אויסדריקן). נאָר עקספּערימענטן אין וועלכע AAV אינדזשעקציע רעזולטירט אין אַ זייער הויכער טראַנסדוקציע עפֿעקטיווקייט פֿון דער פּורקינדזשע צעל שיכט (ד״ה כּמעט די גאַנצע שיכט) אין לפּחות צוויי קאָנסעקוטיווע סערעבעלאַרע רינגען ווערן גענוצט. די AAV-טראַנסדוסירטע שלייף איז געוואָרן מיקראָדיסעקטירט פֿאַר איבערנאַכט נאָך-פֿיקסאַציע (4% PFA און 2.5% גלוטאַראַלדעהייד אין 0.1 M קאָקאָאַט באַפֿער) און ווײַטער פּראָצעסירט. פֿאַר EPON עמבעדינג, איז די פֿיקסירטע געוועב געוואַשן געוואָרן מיט 0.1 M נאַטריום קאָקאָאַט באַפֿער (Applichem), און אינקובירט מיט 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) אין 0.1 M נאַטריום קאָקאָאַט באַפֿער (Applichem) 4 שעה, און דערנאָך געוואַשן פֿאַר 2 שעה. איבערחזרן 3 מאָל מיט 0.1 M קאָקאַמיד באַפֿער. דערנאך, איז די ארויפגייענדיקע סעריע פון ​​עטאנאל גענוצט געווארן צו אינקובירן יעדע עטאנאל לייזונג ביי 4°C פאר 15 מינוט צו דעכידראטירן דאס געוועב. דאס געוועב איז אריבערגעפירט געווארן צו פראפילען אקסייד און אינקובירט איבערנאכט אין EPON (Sigma-Aldrich) ביי 4°C. לייגט דאס געוועב אין פרישן EPON ביי צימער טעמפעראטור פאר 2 שעה, און דערנאך איינגעבעטן עס ביי 62°C פאר 72 שעה. ניצט אן אולטראמיקראטאם (Leica Microsystems, UC6) און א דיאמאנט מעסער (Diatome, Biel, שווייץ) צו שניידן 70 נאַנאָמעטער אולטרא-דינע סעקשאַנז, און פארבט מיט 1.5% אוראניל אַצעטאַט פאר 15 מינוט ביי 37°C, און פארבט מיט בליי ציטראַט לייזונג 4 מינוט. די עלעקטראָן מיקראָגראַפס זענען גענומען געווארן מיט א JEM-2100 Plus טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּ (JEOL) אויסגעשטאַט מיט Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) און DigitalMicrograph ווייכווארג (Gatan). פֿאַר אַנאַליז, זענען עלעקטראָן מיקראָגראַפֿן גענומען געוואָרן מיט 5000× אָדער 10,000× דיגיטאַלן זום.
מאָרפאָלאָגישע אַנאַליז פון מיטאָטשאָנדריאַ. פֿאַר אַלע אַנאַליזן, די קאָנטורן פון יחיד מיטאָטשאָנדריאַ זענען מאַנועל אויסגעשמועסט אין דיגיטאַלע בילדער ניצן ImageJ ווייכווארג. פֿאַרשידענע מאָרפאָלאָגישע פּאַראַמעטערס זענען אַנאַליזירט. מיטאָטשאָנדריאַל געדיכטקייט איז אויסגעדריקט ווי אַ פּראָצענט באקומען דורך דיוויידינג די גאַנץ מיטאָטשאָנדריאַל שטח פון יעדער צעל דורך די ציטאָפּלאַזמע שטח (ציטאָפּלאַזמע שטח = צעל שטח-צעל קערן שטח) × 100. די קייַלעכקייַט פון מיטאָטשאָנדריאַ איז קאַלקיאַלייטיד מיט די פאָרמולע [4π∙(שטח/פּערימעטער 2)]. די יסטאַ מאָרפאָלאָגי פון מיטאָטשאָנדריאַ איז אַנאַליזירט און צעטיילט אין צוויי קאַטעגאָריעס ("טובולאַר" און "בלאָסטער") לויט זייער הויפּט פֿאָרמען.
אויטאפֿאַגאָסאָם/ליסאָסאָם נומער און געדיכטקייט אַנאַליז. ניצט ImageJ ווייכווארג צו מאַנועל אויסשטעלן די קאָנטורן פון יעדן אויטאפֿאַגאָסאָם/ליסאָסאָם אין דעם דיגיטאַלן בילד. אויטאפֿאַגאָסאָם/ליסאָסאָם שטח ווערט אויסגעדריקט ווי אַ פּראָצענט קאַלקולירט דורך צעטיילן די גאַנצע אויטאפֿאַגאָסאָם/ליסאָסאָם סטרוקטור שטח פון יעדער צעל דורך די ציטאָפּלאַזם שטח (ציטאָפּלאַזם שטח=צעל שטח-נוקלעאַר שטח)×100. די געדיכטקייט פון אויטאפֿאַגאָסאָמען/ליסאָסאָמען ווערט קאַלקולירט דורך צעטיילן די גאַנצע צאָל דורך די צאָל אויטאפֿאַגאָסאָם/ליסאָסאָם סטרוקטורן פּער צעל (אין טערמינען פון ציטאָפּלאַזמיש שטח) (ציטאָפּלאַזמיש שטח = צעל שטח-נוקלעאַר שטח).
לייבאַלינג פֿאַר אַקוטע סעקשאַנינג און מוסטער צוגרייטונג. פֿאַר עקספּערימענטן וואָס דאַרפן גלוקאָזע לייבאַלינג, טראַנספער די אַקוטע מוח סלייסיז צו אַ פאַר-אינקובאַציע קאַמער, וואָס כּולל סאַטשערייטאַד טשאַד (95% O2 און 5% CO2), הויך Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נאַטריום פאָספֿאַט באַפער, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקאָז, 1.0 mM CaCl2 און 2.0 mM MgCl2, אַדזשאַסטיד צו pH 7.4 און 310 צו 320 mOsm), אין וואָס גלוקאָזע איז 13C6- גלוקאָזע סאַבסטיטוציע (Eurisotop, קאַטאַלאָג נומער CLM-1396). פֿאַר עקספּערימענטן וואָס דאַרפֿן פּירווואַט לייבאַלינג, טראַנספערירט די אַקוטע מוח סלייסיז צו העכער Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נאַטריום פאָספאַט באַפער, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקאָז, 1.0 mM CaCl2 און לייגט צו 2.0 mM MgCl2, אַדזשאַסטירט צו pH 7.4 און 310 צו 320mOsm), און לייגט צו 1 mM 1-[1-13C]פּירווואַט (Eurisotop, קאַטאַלאָג נומער CLM-1082). אינקובירט די סעקשאַנז פֿאַר 90 מינוט ביי 37°C. אין סוף פון די עקספּערימענט, די סעקשאַנז זענען געשווינד געוואַשן מיט אַ וואַסעריק לייזונג (pH 7.4) מיט 75 mM אַמאָוניום קאַרבאָנאַט, און דערנאָך כאָומאַדזשאַנייזד אין 40:40:20 (v:v:v) אַצעטאָניטריל (ACN): מעטאַנאָל: וואַסער. נאכדעם וואס די סעקציעס זענען אינקובירט געווארן אויף אייז פאר 30 מינוט, זענען די מוסטערן סענטריפוגירט געווארן ביי 21,000 ג פאר 10 מינוט ביי 4°C, און דער קלארער איבערוואסער איז געטריקנט געווארן אין א SpeedVac קאנצענטראטאר. די רעזולטירנדע געטריקנטע מעטאבאליט פּעלעט איז געהאלטן געווארן ביי -80°C ביז אנאליז.
פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע-מאַסע ספּעקטראָמעטריע אַנאַליז פֿון 13C-געמאַרקטע אַמינאָ זויערן. פֿאַר פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע-מאַסע ספּעקטראָמעטריע (LC-MS) אַנאַליז, איז די מעטאַבאָליט פּעלעט ווידער אויפֿגעסוספּענדירט געוואָרן אין 75μl LC-MS גראַד וואַסער (Honeywell). נאָך צענטריפוגאַציע ביי 21,000 ג פֿאַר 5 מינוט ביי 4°C, איז 20 μl פֿון דעם קלעריפֿיצירטן סופּערנאַטאַנט געניצט געוואָרן פֿאַר אַמינאָ זויער פֿלוס אַנאַליז, בשעת די רעשט פֿון דעם עקסטראַקט איז גלייך געניצט געוואָרן פֿאַר אַניאָן אַנאַליז (זען אונטן). אַמינאָ זויער אַנאַליז איז דורכגעפֿירט געוואָרן מיטן פֿריִער באַשריבענעם בענזאָיל קלאָריד דעריוואַטיזאַציע פּראָטאָקאָל (55, 56). אין דעם ערשטן שריט, איז 10μl פֿון 100 mM נאַטריום קאַרבאָנאַט (Sigma-Aldrich) צוגעגעבן געוואָרן צו 20μl פֿון מעטאַבאָליט עקסטראַקט, און דערנאָך איז 10μl פֿון 2% בענזאָיל קלאָריד (Sigma-Aldrich) צוגעגעבן געוואָרן צום LC גראַד ACN. דער מוסטער איז קורץ געוואָרטעקסט געוואָרן און דערנאָך צענטריפוגירט ביי 21,000 ג פֿאַר 5 מינוט ביי 20°C. טראַנספערירט דעם קלאָרן סופּערנאַטאַנט צו אַ 2 מל אויטאָ-סאַמפּלער וויאַל מיט אַ קאָנישן גלאָז אַריינלייג (200 μl וואָלומען). די מוסטערן זענען אַנאַליזירט געוואָרן מיטן Acquity iClass אולטראַ-הויך פּערפאָרמאַנס LC סיסטעם (Waters) פארבונדן צום Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) הויך-רעזאָלוציע פּרעציזיע מאַסע ספּעקטראָמעטער (Thermo Fisher Scientific). פֿאַר אַנאַליז, איז 2μl פון דעם דעריוואַטיזירטן מוסטער אינדזשעקטירט געוואָרן אין אַ 100×1.0 מם הויך-שטאַרקייט סיליקאַ T3 קאָלום (Waters) וואָס כּולל 1.8μm פּאַרטיקלען. די לויפן קורס איז 100μl/min, און די באַפער סיסטעם באַשטייט פון באַפער A (10 mM אַמאָוניום פֿאָרמאַט און 0.15% פֿאָרמיק זויער אין וואַסער) און באַפער B (ACN). דער גראַדיענט איז ווי פאלגט: 0%B ביי 0 מינוט; 0%B. 0 ביז 15% B ביי 0 ביז 0.1 מינוט; 15 ביז 17% B ביי 0.1 ביז 0.5 מינוט; B ביי 17 ביז 55% ביי 0.5 ביז 14 מינוט; B ביי 55 ביז 70% ביי 14 ביז 14.5 מינוט; ביי 14.5 ביז 70 ביז 100% B ביי 18 מינוט; 100% B ביי 18 ביז 19 מינוט; 100 ביז 0% B ביי 19 ביז 19.1 מינוט; 0% B ביי 19.1 ביז 28 מינוט (55, 56). דער QE-HF מאַסע ספּעקטראָמעטער אַרבעט אין אַ positive ייאַניזאַציע מאָדע מיט אַ מאַסע קייט פון m/z (מאַסע/לאָד פאַרהעלטעניש) פון 50 צו 750. די אַפּליצירטע רעזאָלוציע איז 60,000, און די געווינס קאָנטראָל (AGC) יאָן ציל באקומען איז 3×106, און די מאַקסימום יאָן צייט איז 100 מיליסעקונדעס. די העאַטעד עלעקטראָספּריי ייאַניזאַציע (ESI) מקור אַרבעט ביי אַ שפּריץ וואָולטידזש פון 3.5 kV, אַ קאַפּילאַר טעמפּעראַטור פון 250°C, אַ שייד לופט לויפן פון 60 AU (אַרביטראַרי יוניץ), און אַ הילפס לופט לויפן פון 20 AU. 250°C. די S לינז איז געשטעלט צו 60 AU.
אניאָן כראָמאַטאָגראַפֿיע-MS אַנאַליז פֿון 13C מאַרקירטע אָרגאַנישע זויערן. דער איבערבליבענער מעטאַבאָליט אָפּזאַץ (55μl) איז אַנאַליזירט געוואָרן מיט אַ דיאָנעקס יאָן כראָמאַטאָגראַפֿיע סיסטעם (ICS 5000+, טערמאָ פֿישער סייענטיפיק) פֿאַרבונדן צו אַ QE-HF מאַסע ספּעקטראָמעטער (טערמאָ פֿישער סייענטיפיק). אין קורצן, 5μl פֿון מעטאַבאָליט עקסטראַקט איז אינדזשעקטירט געוואָרן אין אַ דיאָנעקס יאָןפּאַק AS11-HC קאָלום אויסגעשטאַט מיט HPLC (2 mm×250 mm, פּאַרטיקל גרייס 4μm, טערמאָ פֿישער סייענטיפיק) אין אַ פּוש-אין פּאַרטיאַלער שלייף מאָדע מיט אַ פֿיל פאַרהעלטעניש פֿון 1. דיאָנעקס יאָןפּאַק AG11-HC גאַרד קאָלום (2 mm x 50 mm, 4μm, טערמאָ פֿישער סייענטיפיק). די קאָלום טעמפּעראַטור ווערט געהאַלטן ביי 30°C, און דער אויטאָ-סאַמפּלער ווערט געשטעלט צו 6°C. ניצט אַ פּאָטאַסיום הידראָקסייד קאַרטרידזש צוגעשטעלט מיט דעיאָניזירט וואַסער צו דזשענערירן אַ פּאָטאַסיום הידראָקסייד גראַדיענט דורך דעם עלוענט גענעראַטאָר. צעשיידונג פון מעטאַבאָליטן מיט אַ שטראָם ראַטע פון ​​380μl/min, אַפּליקירנדיק דעם פאלגנדן גראַדיענט: 0 ביז 3 מינוט, 10 mM KOH; 3 ביז 12 מינוט, 10 ביז 50 mM KOH; 12 ביז 19 מינוט, 50 ביז 100 mM KOH; 19 ביז 21 מינוט, 100 mM KOH; 21 ביז 21.5 מינוט, 100 ביז 10 mM KOH. די קאָלום איז ווידער-עקוויליברירט געוואָרן אונטער 10 mM KOH פֿאַר 8.5 מינוט.
די אויסגעלאָזטע מעטאַבאָליטן ווערן קאָמבינירט מיט אַ 150μl/min איזאָפּראָפּאַנאָל סופּלעמענט שטראָם נאָך דער קאָלום און דערנאָך געשיקט צו אַ הויך-רעזאָלוציע מאַסע ספּעקטראָמעטער וואָס אַרבעט אין נעגאַטיוו ייאַניזאַציע מאָדע. MS מאָניטאָרט דעם מאַסע קייט פון m/z 50 ביז 750 מיט אַ רעזאָלוציע פון ​​60,000. די AGC איז געשטעלט צו 1×106, און די מאַקסימום יאָן צייט איז געהאלטן ביי 100 ms. די באַהייצטע ESI מקור איז געווען אַפּערירט ביי אַ שפּריץ וואָולטידזש פון 3.5 kV. די אנדערע סעטטינגס פון די יאָן מקור זענען ווי גייט: קאַפּילאַר טעמפּעראַטור 275°C; שייד גאַז לויפן, 60 AU; הילפס גאַז לויפן, 20 AU ביי 300°C, און S לענס שטעלונג צו 60 AU.
דאטן אנאליז פון 13C באצייכנטע מעטאבאליטן. ניצט TraceFinder ווייכווארג (ווערסיע 4.2, Thermo Fisher Scientific) פאר דאטן אנאליז פון איזאטאפ פראפארציע. די אידענטיטעט פון יעדער קאמפאונד איז וועריפיצירט געווארן דורך א פארלעסלעכער רעפערענץ קאמפאונד און זעלבשטענדיג אנאליזירט. כדי צו דורכפירן איזאטאפ אנרייכערונג אנאליז, איז די שטח פון די עקסטראקטירטע יאָן כראָמאַטאָגראַם (XIC) פון יעדן 13C איזאטאפ (Mn) עקסטראקטירט געווארן פון [M + H]+, וואו n איז די טשאַד נומער פון די ציל קאמפאונד, גענוצט צו אנאליזירן אַמינאָ זויערן אדער [MH]+ ווערט גענוצט צו אנאליזירן אניאָנען. די מאַסע אַקיעראַסי פון XIC איז ווייניקער ווי פינף טיילן פּער מיליאָן, און די אַקיעראַסי פון RT איז 0.05 מינוט. די אנרייכערונג אנאליז איז דורכגעפירט דורך קאַלקולירן די פראפארציע פון ​​יעדן דעטעקטירטן איזאטאפ צו די סומע פון ​​אלע איזאטאפן פון די קארעספאנדירנדע קאמפאונד. די פראפארציעס ווערן געגעבן ווי פּראָצענט ווערטן פאר יעדן איזאטאפ, און די רעזולטאטן ווערן אויסגעדריקט ווי מאָלאַר פּראָצענט אנרייכערונג (MPE), ווי פריער באשריבן (42).
דער איינגעפֿרוירענער נעוראָן פּעלעט איז האָמאָגעניזירט געוואָרן אין אייז-קאַלטן 80% מעטאַנאָל (v/v), געוואָרטעקסט, און אינקובירט ביי -20°C פֿאַר 30 מינוט. וואָרטעקסט דעם מוסטער ווידער און מישט ביי +4°C פֿאַר 30 מינוט. דער מוסטער איז סענטריפוגירט געוואָרן ביי 21,000 ג פֿאַר 5 מינוט ביי 4°C, און דערנאָך איז דער רעזולטאַט סופּערנאַטאַנט געזאַמלט און געטריקנט מיט אַ SpeedVac קאָנצענטראַטאָר ביי 25°C פֿאַר ווייטערדיקער אַנאַליז. ווי באַשריבן אויבן, איז LC-MS אַנאַליז דורכגעפֿירט געוואָרן אויף די אַמינאָ זויערן פֿון די סאָרטירטע צעלן. מיט TraceFinder (ווערסיע 4.2, Thermo Fisher Scientific), איז דאַטן אַנאַליז דורכגעפֿירט געוואָרן מיט דער מאָנאָאיזאָטאָפּישער מאַסע פֿון יעדער קאַמפּאַונד. קוואַנטיל נאָרמאַליזאַציע פֿון מעטאַבאָליט דאַטן איז דורכגעפֿירט געוואָרן מיט דעם preprocessCore ווייכווארג פּעקל (57).
צוגרייטונג פון די שניטן. די מויז איז שנעל אנעסטעזירט געווארן מיט קוילן דייאקסייד און אפגעשניטן פון דעם קאפ, דער מוח איז שנעל ארויסגענומען געווארן פון דעם שאדן, און דער מיט אייז געפילטער וויברירנדיקער מעסער (HM-650 V, טערמא פישער סייענטיפיק, וואלדארף, דייטשלאנד) איז גענוצט געווארן צו שניידן עס אין 300 ביז 375 מיקראָמעטער סאַגיטאַלע סעקשאַנז. קאַלטע קוילן גאַזיפיקאַציע (95% O2 און 5% CO2). נידעריק Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נאַטריום פאָספֿאַט באַפֿער, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקאָז, 1.0 mM CaCl2 און 6.0 mM MgCl2. צופּאַסן צו pH 7.4 און 310 ביז 330 mOsm). טראַנספערירט די באַקומענע מוח-שְׁנײַדלעך צו אַ קאַמער וואָס ענטהאַלט העכער Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נאַטריום פאָספֿאַט באַפֿער, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-גלוקאָז, 4.0 mM CaCl2 און mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 און 310 ביז 320 mOsm). האַלט די שְׁנײַדלעך פֿאַר 20 ביז 30 מינוט אַזוי אַז זיי קענען ווערן צוריקגעשטעלט איידער רעקאָרדינג.
רעקאָרדינג. א מיקראָסקאָפּ בינע אויסגעשטאַט מיט אַ פאַרפעסטיקט רעקאָרדינג קאַמער און אַ 20x וואַסער טונקען אָביעקטיוו לינז (סייענטיפיקאַ) איז געניצט געוואָרן פֿאַר אַלע רעקאָרדינגס. די מעגלעכע פּורקינדזשע צעלן זענען אידענטיפיצירט געוואָרן דורך (i) גוף גרייס, (ii) אַנאַטאָמישע אָרט פון די סערעבעללום, און (iii) אויסדרוק פון די פלורעסענט mtYFP רעפּאָרטער דזשין. די פּאַטש פּיפּעט מיט אַ שפּיץ קעגנשטעל פון 5 צו 11 מעגאָהמס איז אַרויסגעצויגן דורך אַ באָראָסיליקאַט גלאז קאַפּילאַר (GB150-10, 0.86 מם × 1.5 מם × 100 מם, סייענס פּראָדוקטן, האָפהיים, דייטשלאַנד) און אַ האָריזאָנטאַל פּיפּעט אינסטרומענטן (P-1000, סאַטער), נאָוואַטאָ, קאַליפאָרניע). אַלע רעקאָרדינגס זענען דורכגעפירט געוואָרן דורך ELC-03XS npi פּאַטש קלאַמפּ אַמפּליפייער (npi עלעקטראָניק גאַמב"ה, טאַם, דייטשלאַנד), וואָס איז קאָנטראָלירט געוואָרן דורך די ווייכווארג סיגנאַל (ווערסיע 6.0, קעמברידזש עלעקטראָניק, קעמברידזש, וק). דער עקספּערימענט איז רעקאָרדירט ​​געוואָרן מיט אַ סאַמפּלינג קורס פון 12.5 kHz. דער סיגנאַל ווערט געפילטערט מיט צוויי קורץ-דורכגאַנג בעסעל פילטערס מיט אָפּשנייד-פרעקווענצן פון 1.3 און 10 kHz בהתאמה. די קאַפּאַסיטאַנס פון דער מעמבראַן און דער פּיפּעטע ווערט קאָמפּענסירט דורך דעם קאָמפּענסאַציע-קרייז מיטן נוצן דעם אַמפּליפייער. אַלע עקספּערימענטן זענען דורכגעפירט געוואָרן אונטער דער קאָנטראָל פון אַן אָרקאַ-פלאַש 4.0 קאַמעראַ (האַמאַמאַצו, גערדען, דייטשלאַנד), וואָס איז קאָנטראָלירט געוואָרן דורך דער האָקאַוואָ ווייכווארג (ווערסיע 2.8, האַמאַמאַצו, גערדען, דייטשלאַנד).
רוטינע גאַנצע-צעל קאָנפיגוראַציע און אַנאַליז. גלייך איידער רעקאָרדינג, פּלאָמבירן די פּיפּעטע מיט דער אינעווייניקסטער לייזונג וואָס כּולל די פאלגענדע סאַבסטאַנסיז: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM פּאָטאַסיום גלוקאָנאַט, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM גואַנאָסין טריפאָספאַט (GTP) (Na) און 10.0 mM קרעאַטינין פאָספאַט זענען אַדזשאַסטיד צו pH 7.25, און דער אָסמאָטישער דרוק איז געווען 290 mOsm (סוקראָז). גלייך נאָך אַפּלייינג אַ קראַפט פון 0 pA צו צערייסן די מעמבראַנע, די רו מעמבראַנע פּאָטענציעל איז געמאסטן. די אַרייַנשרייַב קעגנשטעל איז געמאסטן דורך אַפּלייינג כייפּערפּאָלאַרייזד קעראַנץ פון -40, -30, -20, און -10 pA. מעסט די מאַגניטוד פון די וואָולטידזש ענטפער און נוצן אָהם ס געזעץ צו רעכענען די אַרייַנשרייַב קעגנשטעל. ספּאָנטאַנע טעטיקייט איז רעקאָרדירט ​​געוואָרן אין אַ וואָלטאַזש קלאַמער פֿאַר 5 מינוט, און sPSC איז אידענטיפֿיצירט און געמאָסטן געוואָרן אין Igor Pro (ווערסיע 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ניצנדיק אַ האַלב-אָטאָמאַטישן דערקענונג סקריפּט. די IV קורווע און סטאַביל-שטאַט קראַנט ווערן געמאָסטן דורך קלאַמערן די באַטאַרייע ביי פֿאַרשידענע פּאָטענציאַלן (אָנהייבנדיק פֿון -110 mV) און פֿאַרגרעסערן דעם וואָלטאַזש אין 5 mV טריט. די פּראָדוקציע פֿון AP איז געטעסט געוואָרן דורך אַפּליצירן אַ דעפּאָלאַריזירנדיקן קראַנט. קלאַמערט די צעל ביי -70 mV בשעת מען אַפּליצירט אַ דעפּאָלאַריזירנדיקן קראַנט פּולס. אַדזשאַסטירט די טריט גרייס פֿון יעדער רעקאָרדינג אַפּאַראַט באַזונדער (10 ביז 60 pA). רעכנט אויס די מאַקסימום AP אָפֿטקייט דורך מאַנועל ציילן די פּולס ספּייקס וואָס פֿאַראורזאַכן די העכסטע AP אָפֿטקייט. די AP שוועל ווערט אַנאַליזירט דורך ניצן די צווייטע דעריוואַטיוו פֿון דעם דעפּאָלאַריזאַציע פּולס וואָס ערשטער טריגערט איין אָדער מער APs.
פּערפאָרירטע פּאַטש קאָנפיגוראַציע און אַנאַליז. דורכפירן פּערפאָרירטע פּאַטש רעקאָרדינג מיט סטאַנדאַרט פּראָטאָקאָלן. ניצן אַן ATP- און GTP-פֿרייַ פּיפּעט וואָס כּולל נישט די פֿאָלגנדיקע ינגרידיאַנץ: 128 mM גלוקאָנאַט K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA און 2 mM MgCl2, און אַדזשאַסטירן צו pH 7.2 (ניצן KOH). ATP און GTP ווערן אויסגעלאָזט פֿון דער אינטראַצעלולאַרער לייזונג צו פֿאַרהיטן אַנקאַנטראָלירטע פּערמעאַביליטי פֿון דער צעל מעמבראַנע. די פּאַטש פּיפּעט איז אָנגעפֿילט מיט אַן אַמפאָטעריצין-האַלטנדיקער אינערלעכער לייזונג (בעערעך 200 ביז 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) צו באַקומען אַ פּאַנטשעד פּאַטש רעקאָרד. אַמפאָטעריצין איז געווען אויפֿגעלייזט אין דימעטהיל סולפֿאָקסייד (לעצט קאָנצענטראַציע: 0.1 ביז 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). די קאָנצענטראַציע פֿון DMSO וואָס איז געניצט געוואָרן האָט נישט געהאַט קיין באַדייטנדיקע ווירקונג אויף די נעוראָנען וואָס זענען שטודירט געוואָרן. בעת דעם לאָך־פּראָצעס, איז דער קאַנאַל־קעגנשטאַנד (Ra) קאָנטינויִערלעך מאָניטאָרירט געוואָרן, און דער עקספּערימענט איז אָנגעהויבן געוואָרן נאָכדעם וואָס די אַמפּליטוד פון Ra און AP האָט זיך סטאַביליזירט (20-40 מינוט). ספּאָנטאַנע אַקטיוויטעט ווערט געמאָסטן אין אַ וואָלטאַזש און/אָדער קראַנט קלאַמער פֿאַר 2 ביז 5 מינוט. דאַטן־אַנאַליז איז דורכגעפֿירט געוואָרן מיט Igor Pro (ווערסיע 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (ווערסיע 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) און GraphPad Prism (ווערסיע 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). פאַראייניקטע שטאַטן). כּדי צו ידענטיפֿיצירן ספּאָנטאַנע APs, ווערט גענוצט IgorPro'ס NeuroMatic v3.0c פּלאַגין. אויטאָמאַטיש ידענטיפֿיצירט APs מיט אַ געגעבענעם שוועל, וואָס ווערט אינדיווידועל אַדזשאַסטירט פֿאַר יעדן רעקאָרד. ניצנדיק דעם ספּייק אינטערוואַל, באַשטימט די ספּייק־פֿרעקווענץ מיט דער מאַקסימום אינסטאַנטאַניער ספּייק־פֿרעקווענץ און דער דורכשניטלעכער ספּייק־פֿרעקווענץ.
PN איזאָלאַציע. דורך אַדאַפּטירן צו דעם פריער פאַרעפֿנטלעכטן פּראָטאָקאָל, איז PNs גערייניקט געוואָרן פֿון דעם מויז סערעבעללום אין אַ ספּעציפֿישער שטאַפּל (58). אין קורצן, דער סערעבעללום איז דיסעקטירט און געמאָלן געוואָרן אין אייז-קאַלטן דיסאָסיאַציע מעדיום [אָן HBSS Ca2+ און Mg2+, סופּלעמענטירט מיט 20 mM גלוקאָזע, פּעניסיללין (50 U/ml) און סטרעפּטאָמיצין (0.05 mg/ml)], און דערנאָך פֿאַרדייַען דעם מעדיום אין פּאַפּאַין [HBSS, סופּלעמענטירט מיט 1-ציסטאין·HCl (1 mg/ml), פּאַפּאַין (16 U/ml) און דעאָקסיריבאָנוקלעאַז I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. באַהאַנדלען פֿאַר 30 מינוט ביי 30°C. ערשט וואַשט די געוועבן אין HBSS מעדיום וואָס ענטהאַלט אייער שלייַם (10 מג/מל), BSA (10 מג/מל) און DNase (0.1 מג/מל) ביי צימער טעמפּעראַטור צו פאַרמייַדן ענזימאַטישע דיידזשעסטשאַן, און דערנאָך אין די HBSS מעדיום וואָס ענטהאַלט 20 mM גלוקאָזע. לײַכט צעמאָלן אין HBSS, פּעניסיללין (50 U/ml), סטרעפּטאָמיצין (0.05 מג/מל) און DNase (0.1 מג/מל) באַפֿרײַען אײנציקע צעלן. די רעזולטאַט צעל סאַספּענשאַן איז געווען פֿילטרירט דורך אַ 70μm צעל זיפּ, דערנאָך די צעלן זענען פּעלעטירט דורך צענטריפוגאַציע (1110 rpm, 5 מינוט, 4°C) און ריסוספּענדעד אין סאָרטינג מעדיום [HBSS, סאַפּלאַמענטאַד מיט 20 mM גלוקאָזע, 20% פעטאַל רינדער] סערום, פּעניסיללין (50 U/ml) און סטרעפּטאָמיצין (0.05 מג/מל)]; אָפּשאַצן צעל לעבנספֿעיִקייט מיט פּראָפּידיום יאָדיד און אַדזשאַסטירן די צעל געדיכטקייט צו 1×106 צו 2×106 צעלן/מל. פאר פלוס ציטאָמעטריע, איז די סאַספּענשאַן געפילטערט געוואָרן דורך אַ 50 μm צעל זיפּ.
פלוס ציטאָמעטער. צעל סאָרטינג איז דורכגעפירט געוואָרן ביי 4°C מיט אַ FACSAria III מאַשין (BD Biosciences) און FACSDiva ווייכווארג (BD Biosciences, ווערסיע 8.0.1). די צעל סאַספּענשאַן איז סאָרטירט געוואָרן מיט אַ 100 μm נאָזל אונטער אַ דרוק פון 20 psi מיט אַ קורס פון ~2800 געשעענישן/סעק. ווייל טראַדיציאָנעלע גייטינג קריטעריאַ (צעל גרייס, בימאָדאַל דיסקרימינאַציע, און סקאַטערינג קעראַקטעריסטיקס) קענען נישט ענשור די ריכטיקע אפגעזונדערטקייט פון PN פון אַנדערע צעל טיפּן, איז די גייטינג סטראַטעגיע באַשטימט באַזירט אויף דעם דירעקטן פאַרגלייַך פון די YFP אינטענסיטעט און אויטאָפלאָרעסענס אין מיטאָYFP+ ​​און די קאָנטראָל מיטאָYFP − מײַז. YFP ווערט אויפֿגעוועקט דורך באַשטראַלן דעם מוסטער מיט אַ 488 נם לאַזער ליניע, און דער סיגנאַל ווערט דעטעקטירט מיט אַ 530/30 נם באַנד פּאַס פֿילטער. אין מיטאָYFP+ ​​מײַז, ווערט די רעלאַטיווע שטאַרקייט פון די Rosa26-mitoYFP רעפּאָרטער דזשין אויך געניצט צו אונטערשיידן נעוראָנאַל גוף און אַקסאָן פראַגמענטן. 7-AAD ווערט אויפגעוועקט מיט א 561 נאַנאָמעטער געלן לאַזער און דעטעקטירט מיט א 675/20 נאַנאָמעטער באַנדפּאַס פילטער צו אויסשליסן טויטע צעלן. כּדי צו צעשיידן אַסטראָציטן אין דער זעלבער צייט, איז די צעל סאַספּענשאַן געפֿאַרבט געוואָרן מיט ACSA-2-APC, דערנאָך איז די מוסטער באַשטראַלט געוואָרן מיט אַ 640 נאַנאָמעטער לאַזער ליניע, און אַ 660/20 נאַנאָמעטער באַנדפּאַס פילטער איז געניצט געוואָרן צו דעטעקטירן דעם סיגנאַל.
די געזאמלטע צעלן זענען געוואָרן צעפעלעטירט דורך צענטריפוגאַציע (1110 רפּם, 5 מינוט, 4°C) און געהיט ביי -80°C ביז נוצן. Mfn2cKO מײַז און זייערע יונגעלעך זענען קלאַסיפֿיצירט געוואָרן דעם זעלבן טאָג צו מינימיזירן פּראָצעדוראַלע וועריאַביליטי. FACS דאַטן פּרעזענטאַציע און אַנאַליז זענען דורכגעפֿירט געוואָרן מיט FlowJo ווייכווארג (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
ווי דערמאנט אויבן (59), ווערט רעאל-צייט PCR גענוצט צו אפגעזונדערן DNA פון די סארטירטע נעוראנען פאר דערנאך mtDNA קוואנטיפיקאציע. די לינעאריטעט און שוועל סענסיטיוויטי זענען אנפאנגס געטעסט געווארן דורך לויפן qPCR אויף פארשידענע צאלן צעלן. בקיצור, זאמלט 300 PN אין א ליזיס בופער באשטייענדיק פון 50 mM טריס-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 און פראטעינאזע K (200 ng/ml) און אינקובירט ביי 55°C 120 מינוט. די צעלן זענען ווייטער אינקובירט געווארן ביי 95°C פאר 10 מינוט צו זיכער מאכן פולשטענדיגע אינאקטיוואציע פון ​​פראטעינאזע K. ניצנדיק א TaqMan פראבע (Thermo Fisher) ספעציפיש צו mt-Nd1, איז mtDNA געמאסטן געווארן דורך האלב-קוואנטיטאטיווע PCR אין די 7900HT רעאל-צייט PCR סיסטעם (Thermo Fisher Scientific). וויסנשאַפט, קאַטאַלאָג נומער Mm04225274_s1), mt-Nd6 (טהערמאָ פישער סייענטיפיק, קאַטאַלאָג נומער AIVI3E8) און 18S (טהערמאָ פישער סייענטיפיק, קאַטאַלאָג נומער Hs99999901_s1) גענעס.
פּראָטעאָם מוסטער צוגרייטונג. דורך הייצן די לייזונג ביי 95°C פֿאַר 10 מינוט און סאָניקירן, אין די ליזיס באַפער [6 M גואַנידין קלאָריד, 10 mM טריס(2-קאַרבאָקסיעטהיל) פאָספין הידראָטשלאָריד, 10 mM כלאָראָאַסעטאַמיד און 100 mM טריס- ליז געפֿרוירענע נעוראָן פּעלעטס אין HCl]. אויף ביאָרופּטאָר (דיאַגענאָוד) פֿאַר 10 מינוט (30 סעקונדעס פּולס / 30 סעקונדעס פּויזע פּעריאָד). די מוסטער איז געווען דיילוטאַד 1:10 אין 20 mM טריס-HCl (pH 8.0), געמישט מיט 300 ng טריפּסין גאָלד (פּראָמעגאַ), און אינקובירט איבער נאַכט ביי 37°C צו דערגרייכן גאַנץ דיידזשעסטשאַן. אויף די צווייטע טאָג, די מוסטער איז געווען סענטריפוגירט ביי 20,000 g פֿאַר 20 מינוט. די סופּערנאַטאַנט איז געווען דיילוטאַד מיט 0.1% פאָרמיק זויער, און די לייזונג איז געווען דעסאַלטיד מיט זיך-געמאַכט StageTips. דער מוסטער איז געטריקנט געוואָרן אין אַ SpeedVac אינסטרומענט (Eppendorf קאָנצענטראַטאָר פּלוס 5305) ביי 45°C, און דערנאָך איז דער פּעפּטיד סוספּענדירט געוואָרן אין 0.1% פאָרמישער זויער. אַלע מוסטערן זענען צוגעגרייט געוואָרן גלײַכצײַטיק דורך דער זעלבער פּערזאָן. כּדי צו אַנאַליזירן אַסטראָציט מוסטערן, זענען 4 μg דעזאַלץ פּעפּטיידן באַצייכנט געוואָרן מיט אַ טאַנדעם מאַסע טאַג (TMT10plex, קאַטאַלאָג נומער 90110, Thermo Fisher Scientific) מיט אַ פּעפּטיד צו TMT רעאַגענט פאַרהעלטעניש פון 1:20. פֿאַר TMT באַצייכענונג, איז 0.8 מג פון TMT רעאַגענט ווידער סוספּענדירט געוואָרן אין 70 μl פון אַנהידראָוס ACN, און דער געטריקנטער פּעפּטיד איז רעקאָנסטיטויִרט געוואָרן אין 9 μl פון 0.1 M TEAB (טריעטילאַמאָניום ביקאַרבאָנאַט), צו וועלכן 7 μl פון TMT רעאַגענט אין ACN איז צוגעגעבן געוואָרן. די קאָנצענטראַציע איז געווען 43.75%. נאָך 60 מינוט פון אינקובאַציע, איז די רעאַקציע געשטערט געוואָרן מיט 2 μl פון 5% הידראָקסילאַמין. די באצייכנטע פּעפּטיידן זענען געזאמלט געוואָרן, געטריקנט, ווידער אויפגעהענגט אין 200μl פון 0.1% פאָרמיש זויער (FA), צעטיילט אין צוויי, און דערנאָך דעזאַלץ מיט זעלבסט-געמאַכטע StageTips. מיט אַן UltiMate 3000 אולטראַ הויך פּערפאָרמאַנס פליסיק כראָמאַטאָגראַף (UltiMate 3000 אולטראַ הויך פּערפאָרמאַנס פליסיק כראָמאַטאָגראַף), איז איינע פון ​​די צוויי העלפטן געווען פראַקציאָנירט אויף אַ 1 מם x 150 מם Acquity כראָמאַטאָגראַפֿישער קאָלום אָנגעפילט מיט 130Å1.7μm C18 פּאַרטיקלען (וואָטערס, קאַטאַלאָג נומער SKU: 186006935). טערמאָ פישער סייענטיפיק). צעשיידן פּעפּטיידן מיט אַ לויפן קורס פון 30μl/min, צעשיידן פון 1% צו 50% באַפער B פֿאַר 85 מינוט מיט אַ שריט-ווײַז גראַדיענט פון 96 מינוט, פון 50% צו 95% באַפער B פֿאַר 3 מינוט, דערנאָך 8 מינוט פֿאַר 95% באַפער B; באַפער A איז 5% ACN און 10 mM אַמאָוניום ביקאַרבאָנאַט (ABC), און באַפער B איז 80% ACN און 10 mM ABC. זאַמלט פראַקציעס יעדע 3 מינוט און פֿאַראייניקט זיי אין צוויי גרופּעס (1 + 17, 2 + 18, אאז"וו) און טריקנט זיי אין אַ וואַקוום צענטריפוגע.
LC-MS/MS אנאליז. פאר מאסע ספעקטראמעטריע, זענען די פעפטיידן (נומער r119.aq) אפגעזונדערט געווארן אויף א 25 ס״מ, 75 μm אינערלעכער דיאמעטער פיקאפריד אנאליטישע זייל (נייע אביעקטיוו לינזע, טייל נומער PF7508250) אויסגעשטאט מיט 1.9 μm רעפראסיל-פור 120 C18-AQ מעדיום (דר. מאיש, מאט), ניצן EASY-nLC 1200 (טהערמא פישער סייענטיפיק, דייטשלאנד). די זייל איז געהאלטן געווארן ביי 50°C. באפערס A און B זענען 0.1% פארמיק זויער אין וואסער און 0.1% פארמיק זויער אין 80% ACN, בהתאמה. פעפטיידן זענען אפגעזונדערט געווארן פון 6% צו 31% באפערס B פאר 65 מינוט און פון 31% צו 50% באפערס B פאר 5 מינוט מיט א גראדיענט פון 200 nl/min. די ארויסגעלאזטע פעפטיידן זענען אנאליזירט געווארן אויף אן ארביטרעפ פיוזשן מאסע ספעקטראמעטער (טהערמא פישער סייענטיפיק). פּעפּטיד פאָרגייער m/z מעסטונג ווערט דורכגעפירט מיט אַ רעזאָלוציע פון ​​120,000 אין די קייט פון 350 ביז 1500 m/z. ניצנדיק 27% נאָרמאַליזירטע קאָליזיע ענערגיע, ווערט דער שטאַרקסטער פאָרגייער מיט אַ טשאַרדזש שטאַט פון 2 ביז 6 אויסגעקליבן פֿאַר הויך ענערגיע C טראַפּ דיסאָסיאַציע (HCD) שפּאַלטונג. די ציקל צייט ווערט באַשטימט צו 1 סעקונדעס. דער m/z ווערט פון דעם פּעפּטיד פראַגמענט איז געמאָסטן געוואָרן אין דער יאָן טראַפּ ניצנדיק דעם קלענסטן AGC ציל פון 5×104 און די מאַקסימום אינדזשעקשאַן צייט פון 86 ms. נאָך פראַגמענטאַציע, איז דער פאָרגייער געשטעלט געוואָרן אויף דער דינאַמישער אויסשליסונג רשימה פֿאַר 45 סעקונדעס. TMT-געמארקטע פּעפּטיידן זענען אפגעזונדערט געוואָרן אויף אַ 50 סענטימעטער, 75 מיקראָמעטער Acclaim PepMap קאָלום (Thermo Fisher Scientific, קאַטאַלאָג נומער 164942), און די מיגראַציע ספּעקטראַ זענען אַנאַליזירט געוואָרן אויף אַן Orbitrap Lumos Tribrid מאַסע ספּעקטראָמעטער (Thermo Fisher Scientific) אויסגעשטאַט מיט הויך-פעלד אַסימעטרישע כוואַליעפאָרם יאָנען (FAIMS) עקוויפּמענט (Thermo Fisher Scientific) אַרבעט ביי צוויי קאָמפּענסאַציע וואָולטידזשעס פון −50 און −70 V. MS3 אויסגעקליבן באַזירט אויף די סינקראָניזאַציע פּרעקורסאָר איז געניצט פֿאַר TMT באַריכט יאָן סיגנאַל מעסטונג. די פּעפּטיד צעשיידונג איז דורכגעפירט געוואָרן אויף EASY-nLC 1200, ניצן אַ 90% לינעאַר גראַדיענט עלוטיאָן, מיט אַ באַפער קאָנצענטראַציע פון ​​6% צו 31%; באַפער A איז געווען 0.1% FA, און באַפער B איז געווען 0.1% FA און 80% ACN. די אַנאַליטישע קאָלום איז אַפּערירט ביי 50°C. ניצן FreeStyle (ווערסיע 1.6, Thermo Fisher Scientific) צו שפּאַלטן די אָריגינעלע טעקע לויט די FAIMS קאָמפּענסאַציע וואָולטידזש.
פּראָטעין אידענטיפיקאציע און קוואַנטיפֿיקאַציע. ניצנדיק די אינטעגרירטע אַנדראָמעדאַ זוכמאַשין, איז די אָריגינעלע דאַטן אַנאַליזירט געוואָרן ניצנדיק מאַקסקוואַנט ווערסיע 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). אין דערצו צו די קרע רעקאָמבינאַזע און YFP סיקוואַנסן באַקומען פֿון אַעקוואָרעאַ וויקטאָריאַ, איז פּעפּטיד פֿראַגמענט ספּעקטראַ געזוכט געוואָרן פֿאַר די קאַנאָנישע סיקוואַנס און יסאָפֿאָרם סיקוואַנס פֿון די מויז רעפֿערענץ פּראָטעאָם (פּראָטעאָם ID UP000000589, דאַונלאָודיד פֿון יוניפּראָט אין מאי 2017). מעטהיאָנין אָקסידאַציע און פּראָטעין N-טערמינאַל אַצעטילאַציע זענען געשטעלט געוואָרן ווי וועריאַבאַל מאָדיפֿיקאַציעס; ציסטאין קאַרבאַמאָיל מעטילאַציע איז געשטעלט געוואָרן ווי פֿיקסירטע מאָדיפֿיקאַציעס. די פֿאַרדייאונג פּאַראַמעטערס זענען געשטעלט צו "ספּעציפֿישקייט" און "טריפּסין/P". די מינימום נומער פֿון פּעפּטיידן און רייזער פּעפּטיידן געניצט פֿאַר פּראָטעין אידענטיפיקאַציע איז 1; די מינימום נומער פֿון יינציקע פּעפּטיידן איז 0. אונטער די באַדינגונגען פֿון פּעפּטיד מאַפּע מאַטשינג, איז די פּראָטעין אידענטיפיקאַציע קורס געווען 0.01. די "צווייטע פּעפּטייד" אָפּציע איז ענייבאַלד. ניצט די "גלייַך צווישן ראַנז" אָפּציע צו אַריבערפירן מצליחה אידענטיפיקאַציעס צווישן פאַרשידענע אָריגינעלע טעקעס. ניצט LFQ מינימום פאַרהעלטעניש צייל 1 פֿאַר לייבל-פֿרייַ קוואַנטיפיקאַציע (LFQ) (60). די LFQ אינטענסיטעט איז פֿילטערירט פֿאַר לפּחות צוויי גילטיקע ווערטן אין לפּחות איין גענאָטיפּ גרופּע אין יעדן צייט פונקט, און איז עקסטראַפּאָלירט פֿון אַ נאָרמאַל פאַרשפּרייטונג מיט אַ ברייט פֿון .0.3 און באַוועגט אַראָפּ 1.8. ניצט פּערסעוס קאַמפּיוטינג פּלאַטפאָרמע (https://maxquant.net/perseus/) און R (https://r-project.org/) צו אַנאַליזירן די LFQ רעזולטאַטן. א צוויי-וועג מעסיק t טעסט פֿון די לימאַ ווייכווארג פּעקל איז געניצט פֿאַר דיפערענציעל עקספּרעסיע אַנאַליז (61). עקספּלאָראַטאָרי דאַטן אַנאַליז איז דורכגעפֿירט ניצן ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally און pheatmap. די TMT-באַזירט פּראָטעאָמיקס דאַטן איז אַנאַליזירט ניצן MaxQuant ווערסיע 1.6.10.43. זוכט פאר רויע פּראָטעאָמיקס דאַטן פון UniProt'ס מענטשלעכע פּראָטעאָמיקס דאַטאַבייס, וואָס איז געווען דאַונלאָודיד אין סעפּטעמבער 2018. די אַנאַליז כולל די איזאָטאָפּ ריינקייט קערעקשאַן פאַקטאָר צוגעשטעלט דורך די פאַבריקאַנט. ניצט לימאַ אין R פֿאַר דיפערענציעל אויסדרוק אַנאַליז. די אָריגינעלע דאַטן, דאַטאַבייס זוכן רעזולטאַטן, און דאַטן אַנאַליז וואָרקפלאָו און רעזולטאַטן זענען אַלע סטאָרד אין די ProteomeXchange אַליאַנס דורך די PRIDE שוטעף ריפּאַזאַטאָרי מיט די דאַטן שטעלן אידענטיפיצירער PXD019690.
פונקציאָנעלע אַנאָטאַציעס באַרייכערן די אַנאַליז. דער Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) געצייַג איז גענוצט געוואָרן צו באַשטימען די רייַכקייט פון די פונקציאָנעלע אַנאָטאַציע טערמינען פון די דאַטן סעט ביי 8 וואָכן (פיגור 1). אין קורצן, די קוואַנטיטאַטיווע פּראָטעין רשימה באַקומען פון LC-MS/MS (טאַנדעם מאַסע ספּעקטראָמעטריע) דאַטן אַנאַליז ווערט גענוצט מיט די פאלגענדע פילטער קריטעריאַ: Mus musculus איז אויסגעקליבן ווי די מינים און הינטערגרונט, און די קאַטעגאָריע ווייזט די P ווערט אַדזשאַסטיד דורך Benjamini פֿאַר באַרייכערונג 0.05 אָדער נידעריקער ווערט באַטראַכט ווי באַטייַטיק. פֿאַר דעם גראַפיק, די שפּיץ פינף וידעפדיק קאַטעגאָריעס אין יעדער קלאַסטער באזירט אויף די אַדזשאַסטיד P ווערט ווערן געוויזן. ניצן קייפל t-טעסט, ניצן די צוויי-פאַזע לינעאַר בוסט פּראָגראַם פון Benjamini, Krieger, און Yekutieli (Q = 5%), צייט-קורס פּראָטעין אויסדרוק אַנאַליז איז דורכגעפירט אויף די וויכטיק קאַנדידאַטן יידענטאַפייד אין יעדער קאַטעגאָריע, און יעדער שורה איז אַנאַלייזד סעפּעראַטלי. עס איז ניט דאַרפֿן צו אַדאַפּט אַ קאָנסיסטענט SD.
כּדי צו פֿאַרגלײַכן די רעזולטאַטן פֿון דער שטודיע מיט פֿאַרעפֿנטלעכטע דאַטאַבייסעס און שאַפֿן אַ ווען דיאַגראַם אין פֿיגור 1, האָבן מיר קאָמבינירט די קוואַנטיטאַטיווע פּראָטעין ליסטע מיט MitoCarta 2.0 אַנאָטאַציעס (24). ניצט דאָס אָנליין געצייַג Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) צו שאַפֿן דעם דיאַגראַם.
פֿאַר דעטאַלירטע אינפֿאָרמאַציע וועגן די סטאַטיסטישע פּראָצעדורן געניצט פֿאַר פּראָטעאָמיקס אַנאַליז, ביטע זען די קאָרעספּאָנדירנדיקע אָפּטייל פון מאַטעריאַלן און מעטאָדן. פֿאַר אַלע אַנדערע עקספּערימענטן, קען מען געפֿינען דעטאַלירטע אינפֿאָרמאַציע אין דער קאָרעספּאָנדירנדיקער לעגענדע. סיידן אַנדערש ספּעציפֿיצירט, אַלע דאַטן זענען אויסגעדריקט ווי דורכשניטלעך ± SEM, און אַלע סטאַטיסטישע אַנאַליזעס זענען דורכגעפֿירט געוואָרן מיט GraphPad Prism 8.1.2 ווייכווארג.
פֿאַר נאָך מאַטעריאַלן פֿאַר דעם אַרטיקל, ביטע זען http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
דאָס איז אַן אָפֿן אַקסעס אַרטיקל פֿאַרשפּרייט אונטער די באַדינגונגען פֿון דער Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, וואָס ערלויבט די נוצן, פֿאַרשפּרייטונג און רעפּראָדוקציע אין יעדן מעדיום, ווי לאַנג ווי די לעצטע נוצן איז נישט פֿאַר קאמערציעלע געווינס און די פּרעמיס איז אַז די אָריגינעלע אַרבעט איז ריכטיק. רעפֿערענץ.
נאטיץ: מיר בעטן אייך נאר צו געבן אייער בליצפּאָסט אַדרעס, אַזוי אַז דער מענטש וואָס איר רעקאָמענדירט צו דער בלאַט זאָל וויסן אַז איר ווילט אַז זיי זאָלן זען דעם בליצפּאָסט און אַז עס איז נישט ספּאַם. מיר וועלן נישט כאַפּן קיין בליצפּאָסט אַדרעסן.
די פראגע ווערט גענוצט צו טעסטן צי איר זענט א באזוכער און צו פארמיידן אויטאמאטישע ספאם אריינשיקונג.
דורך E. מאָטאָרי, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. לאַרסאָן
פּראָטעאָמיקס אַנאַליז פון דיספאַנגקשאַנאַלע נעוראָנען האט געוויזן אַז מעטאַבאַלישע פּראָגראַמען ווערן אַקטיוויזירט צו קעגנשטעלן נעוראָדעגענעראַציע.
דורך E. מאָטאָרי, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. לאַרסאָן
פּראָטעאָמיקס אַנאַליז פון דיספאַנגקשאַנאַלע נעוראָנען האט געוויזן אַז מעטאַבאַלישע פּראָגראַמען ווערן אַקטיוויזירט צו קעגנשטעלן נעוראָדעגענעראַציע.
©2020 אמעריקאנער אַססאָסיאַטיאָן פֿאַר די אַדוואַנסמאַנט פון וויסנשאַפֿט. אַלע רעכט רעזערווירט. AAAS איז אַ שוטעף פון HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef און COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.