איצטיקע†איצטיקע אַדרעס: OX11 0DE, פֿאַראייניקטע קעניגרייך, דיאַמאָנד בילדינג, האַרוועל וויסנשאַפֿט און כידעש פּאַרק, דיעטקאָוט, אָקספֿאָרדשיר, פֿאַראייניקטע קעניגרייך, דיאַמאָנד ליכט סאָורס קאָו., לטד., עלעקטראָנישע ביאָלאָגישע בילדגעבונג צענטער.
דער רעאַקציע צענטער ליכט-כאַרוועסטינג קאָמפּלעקס 1 (RC-LH1) איז דער קערן פאָטאָסינטעטישער קאָמפּאָנענט פון לילאַ פאָטאָטראָפֿישע באַקטעריע. מיר האָבן אײַנגעפֿירט צוויי קריאָ-עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי סטרוקטורן פון דעם RC-LH1 קאָמפּלעקס פֿון Rhodopseudomonas palustris. די 2.65-Å רעזאָלוציע סטרוקטור פון דעם RC-LH114-W קאָמפּלעקס באַשטייט פֿון 14 סוביוניט LH1 שלייפֿן וואָס אַרומרינגלען RC, וואָס איז איבערגעריסן דורך פּראָטעין W, בשעת דער קאָמפּלעקס אָן פּראָטעין-W איז גאָר RC קאָמפּאָזיציע אַרומרינגלט דורך RC. פֿאַרמאַכט 16 סוביוניט LH1 שלייף. דער פֿאַרגלײַך פֿון די סטרוקטורן גיט אײַנבליקן אין די דינאַמיק פֿון קווינאָן אין דעם RC-LH1 קאָמפּלעקס, אַרײַנגערעכנט פֿריִער נישט באַשטימטע קאָנפֿאָרמאַציאָנעלע ענדערונגען ווען קווינאָן בינדט זיך בײַם RC QB אָרט, ווי אויך די לאָקאַציע פֿון הילפֿס-קווינאָן בינדינג ערטער, וואָס העלפֿן זיי דורכפֿירן צו RC. די אײַנציקאַרטיקע סטרוקטור פֿון דעם W פּראָטעין פֿאַרהיט די פֿאַרמאַכונג פֿון דעם LH1 שלייף, דערמיט שאַפֿנדיק אַ קאַנאַל פֿאַר באַשנעלערן דעם קווינאָן/קווינאָלאָן אויסטויש.
די ענערגיע וואָס ווערט צוגעשטעלט דורך פאָטאָסינטעז קען אויסהאַלטן כּמעט אַלע לעבן אויף דער ערד, און עס האט גרויס פּאָטענציאַל פֿאַר זונ - ביאָטעכנאָלאָגיע. בשעת זיי פּראָמאָטירן גלאָבאַלע פאָטאָסינטעז, ווייַזן לילאַ פאָטאָטראָפֿישע באַקטעריעס אויך פֿאַרשידענע ענערגיע מאָדעס און מעטאַבאַלישע מעגלעכקייטן. זיי קענען ויסמיידן פאָטאָסינטעז און וואַקסן ווי העטעראָטראָפֿישע באַקטעריעס אין דער פֿינצטערניש, קענען פֿיקסירן שטיקשטאָף און קאַרבאָן דייאַקסייד, פּראָדוצירן וואַסערשטאָף, און דעגראַדירן אַראָמאַטישע קאַמפּאַונדז (1-3). כּדי צו צושטעלן ענערגיע פֿאַר די פּראָצעסן, מוז ליכט ווערן שנעל און עפֿעקטיוו קאָנווערטירט אין כעמישע ענערגיע. דער פּראָצעס הייבט זיך אָן ווען דער ליכט-פֿאַנגענדיקער אַנטענע קאָמפּלעקס אַבזאָרבירט ליכט און טראַנספֿערירט די פֿאַרכאַפּטע ענערגיע צום רעאַקציע צענטער (RC), דערמיט אָנהייבנדיק אָפּצאָל צעשיידונג (4-7). די גרונט איינהייט פֿון פאָטאָסינטעז אין לילאַ פאָטאָטראָפֿישע באַקטעריעס איז צוזאַמענגעשטעלט פֿון טיפּ 2 RC, אַרומגערינגלט פֿון ליכט-כאַרוועסטינג קאָמפּלעקס 1 (LH1), פֿאָרמענדיק דעם RC-LH1 קערן קאָמפּלעקס. LH1 איז געשאַפֿן דורך אַן אַרעי פֿון קערווד αβ העטעראָדימערס, יעדער פֿון וועלכע בינדט צוויי באַקטיריעלע כלאָראָפֿיל (BChl) a מאָלעקולן און איין אָדער צוויי קאַראָטענאָידן (8-12). די פשוטסטע LH1 אַנטענע באַשטייט פון 16 אָדער 17 αβ העטעראָדימערן וואָס אַרומרינגלען RC (9-13) אין אַ פֿאַרמאַכטן שלייף, אָבער אין אַנדערע קערן קאָמפּלעקסן, טראַנסמעמבראַנע פּעפּטיידן איבעררייַסן די קאָנטינעואַטי פון די אַרומיקע LH1, דערמיט פּראָמאָטירנדיק די קווינאָל/קווינאָן דיפוזיע צווישן RC און ציטאָטשראָם bc1 קאָמפּלעקס (11, 13-15). די לילאַ פאָטאָטראָפֿישע פלאַנץ ראָדאָפּסעודאָמאָנאַס (Rps.) איז אַ מאָדעל אָרגאַניזם וואָס קען פֿאַרשטיין די ענערגיע און עלעקטראָן אַריבערפירן וואָס שטיצט פאָטאָסינטעז. די ערשטע קריסטאַל סטרוקטור פון Rps. דער מאָדעל פון די פּאַלוסטריס RC-LH1 קאָמפּלעקס איז RC, אַרומגערינגלט דורך 15 העטעראָדימערישע LH1 שלייפן, וואָס זענען איבערגעריסן דורך אַן אומבאַקאַנט פּראָטעין גערופן "פּראָטעין W" (14). פּראָטעין-W איז דערנאָך אידענטיפֿיצירט געוואָרן ווי RPA4402, וואָס איז אַן אומבאַקאַנטעריזירטער 10.5kDa פּראָטעין מיט דריי פאָרויסגעזאָגטע טראַנסמעמבראַנע העליקסעס (TMH) (16). מיר פאָרשלאָגן צו טוישן דעם נאָמען פֿון דעם rpa4402 גען וואָס קאָדירט פּראָטעין W צו pufW כּדי צו זײַן קאָנסיסטענט מיט דער נאָמענקלאַטור וואָס ווערט גענוצט פֿאַר גענען וואָס קאָדירן RC-L, M (pufL, pufM) און LH1α, β (pufA, pufB) סוביוניטן. אינטערעסאַנט, פּראָטעין-W איז בלויז פֿאַראַן אין בערך 10% פֿון RC-LH1, וואָס ווײַזט אַז Rps. palustris פּראָדוצירט צוויי פֿאַרשידענע RC-LH1 קאָמפּלעקסן. דאָ באַריכטן מיר די הויך-רעזאָלוציע קריאָ-EM (קריאָ-EM) סטרוקטורן פֿון צוויי קערן קאָמפּלעקסן, איינער מיט פּראָטעין W און 14 αβ העטעראָדימערן, די אַנדערע אָן פּראָטעין W און אַ פֿאַרמאַכטן 16 העטעראָדימער LH1 שלייף. אונדזער סטרוקטור רעפּרעזענטירט אַ שריט ענדערונג אין דעם פֿאַרשטאַנד פֿון דעם RC-LH1 קאָמפּלעקס פֿון Rps. palustris, ווײַל מיר האָבן אַנאַליזירט די האָמאָגענע פּאָפּולאַציע פֿון יעדער וואַריאַנט און האָבן גענוג רעזאָלוציע צו קלאָר באַשטימען יעדן פּעפּטיד און געבונדענע פּיגמענטן און פֿאַרבונדענע ליפּידן און קווינאָנען. דער פארגלייך פון די סטרוקטורן ווייזט אז די דריי TMH פראטעאינען-W וואס זענען ביז איצט נישט געפונען געווארן אין קיין אנדערן RC-LH1 קאמפלעקס, שאפן א קווינאן קאנאל צו פארשנעלערן דעם קווינאן/קווינאן אויסטויש. א צאל קאנסערווירטע ליפיד און קווינאן בינדינג זייטלעך זענען אידענטיפיצירט געווארן, און מיר האבן אנטפלעקט א נייע קאנפארמאציאנעלע ענדערונג נאך דער קאמבינאציע פון ​​קווינאן און RC, וואס קען זיין פאסיג פאר פאטאסיסטעם II (PSII) RC פון זויערשטאף פאטאטראפישע ארגאניזמען. אונזערע געפינסן גיבן נייע איינזיכטן אין די קינעטיק פון קווינאן/קווינאן בינדינג און אויסטויש אין דעם RC-LH1 קערן קאמפלעקס פון לילא פאטאטראפישע באקטעריע.
כּדי צו דערמעגלעכן אַ דעטאַלירטע שטודיע פֿון די צוויי קאָמפּלעקסן געפֿונען אין Rps. palustris, האָבן מיר אפגעזונדערט יעדן RC-LH1 דורך ביאָכעמישע מעטאָדן. דער פּראָטעין W-דעפֿיציענטער קאָמפּלעקס (ווייטער באַצייכנט ווי ΔpufW) איז גערייניקט געוואָרן פֿון דעם שטאַם וואָס פֿעלט דעם pufW גען (16), און נאָר איין RC-LH1 קאָמפּלעקס קען פּראָדוצירט ווערן. דער פּראָטעין W-האַלטיקער קאָמפּלעקס ווערט פּראָדוצירט דורך אַ שטאַם. דער פּראָטעין W פֿון דעם שטאַם ווערט מאָדיפֿיצירט מיט אַ 10x His טאַג ביי זײַן C-טערמינוס, אַזוי אַז דער פּראָטעין W-האַלטיקער קאָמפּלעקס קען עפֿעקטיוו קאָמבינירט ווערן מיט רובֿ פֿעלנדיקן פּראָטעין W דורך אימאָביליזירן מעטאַל. דער קאָמפּלעקס ווערט עפֿעקטיוו אפגעטיילט (16) אַפֿיניטי כראָמאַטאָגראַפֿיע (IMAC).
ווי געוויזן אין פיגור 1, ביידע קאָמפּלעקסן אַנטהאַלטן אַ דריי-אונטער-איינהייטן RC (RC-L, RC-M און RC-H) אַרומגערינגלט מיט אַן LH1 אַנטענע. די 2.80-A סטרוקטור פון דעם קאָמפּלעקס אָן פּראָטעין-W ווייזט 16 αβ העטעראָדימערן, וואָס פאָרמען אַ פֿאַרמאַכטן LH1 שלייף וואָס אַרומרינגלט גאָר RC, ווייטער באַצייכנט ווי דער RC-LH116 קאָמפּלעקס. די 2.65Å סטרוקטור פון דעם פּראָטעין-W-אַנטהאַלטנדיקן קאָמפּלעקס האט אַ 14-העטעראָדימער LH1 איבערגעריסן דורך פּראָטעין-W, ווייטער באַצייכנט ווי RC-LH114-W.
(A און B) אויבערפלאַך רעפּרעזענטאַציע פון ​​דער קאַמפּאַונד. (C און D) געבונדענע פּיגמענטן אויסגעדריקט אין שטאַנגען. (E און F) די קאָמפּלעקסן באמערקט פון דער ציטאָפּלאַזמישער אויבערפלאַך האָבן די פּעפּטיידן און LH1 סוביוניטס רעפּרעזענטירט אין קאַרטאָאָנס, און זענען נומערירט זייגערווייז פון דער פּראָטעין-W ריס [קאָנסיסטענט מיט Rba נומערירונג. sphaeroides קאָמפּלעקס (13)]. פֿאַר LH1-α, די קאָליר פון דער פּראָטעין סוביוניט איז געל; פֿאַר LH1-β, די קאָליר פון דער פּראָטעין סוביוניט איז בלוי; פֿאַר פּראָטעין-W, די פּראָטעין איז רויט; פֿאַר RC-H, עס איז ציאַן; פֿאַר RC-L, עס איז אָראַנדזש; פֿאַר RC-M, מאַגענטאַ. קאָפאַקטאָרן זענען רעפּרעזענטירט דורך שטאַנגען, גרין רעפּרעזענטירט BChl און BPh a מאָלעקולן, לילאַ רעפּרעזענטירט קאַראָטענאָידן, און געל רעפּרעזענטירט UQ10 מאָלעקולן. (G און H) פאַרגרעסערטע מיינונג פון דער פּראָטעין-W ריס אין דער עקוויוואַלענטער געגנט פון RC-LH114-W קאָמפּלעקס (G) און RC-LH116 קאָמפּלעקס (H). קא-פאקטארן ווערן געוויזן אין דער פארעם פון אויספילן דעם פלאץ, כעלירטע קווינאן ווערט געוויזן אין בלוי. די פראטעין-W שפאלט ווערט ארויסגעוויזן מיט א בלויער געשטריכלטער ליניע אין (G), און די קליינע לעכער וואו קווינאן/קווינאלאל פארשפרייט זיך אויפן LH116 רינג ווערן ארויסגעוויזן מיט א שווארצער געשטריכלטער ליניע אין (H).
פיגור 1 (A און B) ווייזט דעם RC ארומגענומען מיט אפענע אדער פארמאכטע רייזעס פון LH1αβ העטעראדימערן, יעדער פון וועלכע בינדט צוויי BChl און איין קאראטענאיד (פיגור 1, C און D). פריערדיגע שטודיעס האבן געוויזן אז Rps איז דער LH1 קאמפלעקס. אין דעם ביאסינטעטישן וועג פון ספּירולינע קסאנטין, אנטהאלטן די מינים געמישטע פאפולאציעס פון קאראטענאידן (17). אבער, ספּיראפיראקסאנטין איז דער דאמינאנטער קאראטענאיד און זיין געדיכטקייט איז צופרידנשטעלנד. דעריבער, האבן מיר אויסגעקליבן צו מאדעלירן ספּיראקסאנטין ביי אלע LH1 בינדינג זייטלעך. די אלפא און ביתא פאלעפעפּטידן זענען איינציקע TMHs מיט קורצע מעמבראן אויסערליכע געגנטן (פיגור 1, A, B, E, און F). כאטש די געדיכטקייט פון 17 רעזידוען ביי דער C-טערמינוס איז נישט באמערקט געווארן, איז דער אלפא פאלעפעפּטיד אפגעשניטן געווארן פון Met1 צו Ala46 אין ביידע קאמפלעקסן. β פאלעפעפּטיד איז רעדוצירט געווארן פון Gly4 צו Tyr52 אין RC-LH116, און פון Ser5 צו Tyr52 אין RC-LH114-W. קיין געדיכטקייט פון 3 אדער 4 N-טערמינאלע אדער 13 C-טערמינאלע רעזידוען איז נישט באמערקט געווארן (פיגור S1). מאסע ספעקטראמעטריע אנאליז פון דעם געמישטן RC-LH1 קאמפלעקס צוגעגרייט פון דעם ווילד-טיפ שטאַם האט געוויזן אז די פעלנדיקע ראיאן איז געווען דער רעזולטאט פון העטעראלאגישע צעשפּאַלטונג פון די פּעפּטיידן (פיגור S1 און S2). די N-טערמינאלע פאָרמילאַציע פון ​​α-Met1 איז אויך באמערקט געווארן (f). די אנאליז האט געוויזן אז דער α-פּעפּטייד באשטייט פון רעזידוען fMet1 ביז Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, און דער β-פּעפּטייד באשטייט פון רעזידוען Ser2 ביז Ala53, וואס איז אין גוטער הסכמה מיט דער נידעריק-טעמפּעראַטור EM געדיכטקייט מאַפּע.
קאָאָרדינאַציע פון ​​α-His29 און β-His36 מאַכט BChls פּנים־צו־פּנים; יעדער αβ העטעראָדימער אַסעמבלט זיך מיט זיינע שכנים צו פאָרמירן אַן אָפֿענע שלייף (RC-LH114-W) אָדער אַ פֿאַרמאַכטע שלייף (RC-LH116) אַרום די RC די עקסיטאָן־געקאַפּלט פּיגמענט אַרעי (פֿיגור 1, C און D). פֿאַרגליכן מיט די 877 נם באַנד פֿון RC-LH114-W, די 880 נם אַבזאָרפּציע רויט־פֿאַרשייבונג פֿון RC-LH116 איז 3 נם (פֿיגור 2A). אָבער, די קייַלעכדיקע דיכראָיזם ספּעקטרום איז כּמעט די זעלבע (פֿיגור 2B), וואָס ווײַזט אַז כאָטש עס איז אַ קלאָרער אונטערשייד צווישן אָפֿענע און פֿאַרמאַכטע שלייפֿן, די לאָקאַלע סביבה פֿון BChls איז זייער ענלעך. די אַבזאָרפּציע רויט־פֿאַרשייבונג קען זײַן דער רעזולטאַט פֿון פֿאַרקלענערטע טערמישע באַוועגונג און פֿאַרגרעסערטע סטאַביליטעט אויף דער פֿאַרמאַכטער שלייף (18, 19), די ענדערונג אין פּיגמענט־פֿאַרבינדונג געפֿירט דורך דער פֿאַרמאַכטער שלייף (20, 21), אָדער אַ קאָמבינאַציע פֿון די צוויי עפֿעקטן (11).
(א) אולטראוויאלעט/זעבאר/נאענט-אינפרארעד אבסארפציע ספעקטרום, וועמענס שפיצן זענען געצייכנט מיט זייערע קארעספאנדירנדע פיגמענטן און נארמאליזירט צו די BPh שפיץ ביי 775 נ"מ. (ב) צירקולארער דיכראיזם ספעקטרום נארמאליזירט צו BChl אבסארבאנס ביי 805 נ"מ. (C און D) אויסגעקליבענע ΔA ספעקטרא פון די צייט-געבונדענע אבסארפציע ספעקטרא פון RC-LH114-W קאמפלעקס (C) און RC-LH116 קאמפלעקס (D). פאר בעסערע פארגלייכבארקייט, זענען אלע ספעקטרא נארמאליזירט צו ∆A פון −A ביי 0.2 ps. (E) די ראטע פון ​​ציטאכראם c2 אקסידאציע נאך באשטראלונג אין דער אנוועזנהייט פון פארשידענע קאנצענטראציעס פון UQ2 (זעה בילד S8 פאר רויע דאטן). (F) אין צעלן וואס וואקסן אונטער נידריגע, מיטלערע אדער הויכע אינטענסיטעט ליכט (10, 30 אדער 300μMm-2 s-1, בהתאמה), די פראטעין W און RC-L סוביוניטס אין דעם רייניגטן קאמפלעקס און די אפגעזונדערטע מעמבראן פארהעלטעניש. באַשטימט דעם פּראָטעין לעוועל דורך SDS-פּאָליאַקרילאַמיד געל עלעקטראָפאָרעזיס און אימונאָאַסיי (זעט פיגור S9 פֿאַר רויע דאַטן). באַשטימט דעם פאַרהעלטעניש אין באַצוג צו דעם פּיוראַפייד RC-LH114-W קאָמפּלעקס. דער סטאָיכיאָמעטרישער פאַרהעלטעניש פון RC-L צו פּראָטעין-W פון דעם קאָמפּלעקס איז 1:1.
די BChls ביי פאזיציע 1 אין דעם דעפארמירטן αβ14 שלייף פון RC-LH114-W (פיגור 1, A, C, און E) זענען נענטער צום RC ערשטיקן דאָנאָר (P) מיט 6.8 Å ווי די עקוויוואַלענטע BChls אין RC-LH116 (פיגור 1, B, D, און F, און פיגור S3); אָבער, די טראַנזיענט אַבזאָרפּציע קינעטיק פון די צוויי קאָמפּלעקסן ווייַזן אַז פֿאַר RC-LH114-W און RC-LH116, די עקסייטיישאַן ענערגיע אַריבערפירן צייט קאָנסטאַנטן פון LH1 צו RC זענען 40 ±4 און 44 ±3 ps (פיגור 2). , C און D, פיגור S4 און טאַבעלע S2). עס איז אויך קיין באַטייטיק חילוק אין עלעקטראָניש אַריבערפירן אין RC (פיגור S5 און פֿאַרבונדענע סאַפּלעמענטאַרי טעקסט). מיר כאָשעד אַז די נאָענטע קאָרעספּאָנדענץ פון די ענערגיע אַריבערפירן צייט צווישן LH1 און RC-P איז רעכט צו דער ענלעכער דיסטאַנסע, ווינקל און פּאָטענציעל ענערגיע פון ​​רובֿ BChl אין די צוויי LH1 שלייפן. עס שיינט אז אויספארשן דעם LH1 ענערגיע מוסטער צו דערגרייכן די מינימאלע דיסטאנץ איז נישט שנעלער ווי דירעקטע ענערגיע טראנספער פון סובאפטימאלע זייטלעך צו RC. די אפענע-לופּ LH1 שלייף אין RC-LH114-W קען אויך דורכגיין אומבאדייטנדיקע טערמישע באוועגונג אונטער נידעריגע טעמפעראטור באדינגונגען פאר סטרוקטורעלע אנאליז, און עס איז דא א לענגערע αβ14 רינג קאנפארמאציע ביי צימער טעמפעראטור פון די פיגמענטאציע דיסטאנץ פון βBChls ביי דער פאזיציע פון ​​RC 1.
דער RC-LH116 קאָמפּלעקס אנטהאלט 32 BChls און 16 קאַראָטענאָידן, און זיין אַלגעמיינע אָרדענונג איז די זעלבע ווי די באַקומען פון טערמאָכראָמאַטיום (Tch.) פּידפּידום [פּראָטעין דאַטאַ באַנק (PDB) ID 5Y5S] (9), טהיאָרהאָדאָוויבריאָ (Trv.) 970 שטאַם (PDB ID 7C9R) (12) און גרינע אַלדזשי (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). נאָך אַליינמאַנט, זענען בלויז קליינע אָפּנייגונגען אין די פּאָזיציעס פון αβ העטעראָדימערס באמערקט געוואָרן, ספּעציעל 1-5, 15, און 16 (פיגור S6). די בייַזייַן פון פּראָטעין-W האט אַ באַטייטיק השפּעה אויף דער סטרוקטור פון LH1. זיינע דריי TMHs זענען פארבונדן דורך קורצע שלייפן, מיטן N-טערמינאַל אויף דער לומען זייט פון דעם קאָמפּלעקס און דעם C-טערמינאַל אויף דער ציטאָפּלאַזמישער זייט (פיגורן 1A און 3, A ביז D). פּראָטעין-W איז לאַרגעלי הידראָפאָביש (פיגור 3B), און TMH2 און TMH3 אינטעראַקטירן מיט LH1αβ-14 צו פאָרמירן אַ טראַנסמעמבראַנע ייבערפלאַך (פיגור 3, B און E צו G). די צובינד איז דער הויפּט צוזאַמענגעשטעלט פון Phe, Leu און Val רעזאַדוז אין די טראַנסמעמבראַנע געגנט. די רעזאַדוז זענען סטאַפּט מיט הידראָפאָבישע אַמינאָ זויערן און αβ-14 פּיגמענטן. עטלעכע פּאָליאַר רעזאַדוז אויך ביישטייערן צו דער אינטעראַקציע, אַרייַנגערעכנט די הידראָגען בונד צווישן W-Thr68 און β-Trp42 אויף דער ייבערפלאַך פון די קאָמפּלעקס קאַוואַטי (פיגור 3, F און G). אויף דער ייבערפלאַך פון די ציטאָפּלאַזמע, Gln34 איז לעבן די קעטאָ גרופּע פון ​​αβ-14 קאַראָטענאָידס. אין דערצו, די n-דאָדעציל β-d-מאַלטאָסייד (β-DDM) מאָלעקול איז געווען רעזאַלווזד, און זיין הידראָפאָבישע עק אויסגעשטרעקט צו די צובינד צווישן פּראָטעין-W און αβ-14, און די ליפּיד עק קען זיין ליגן אין דעם גוף. מיר האָבן אויך באַמערקט אַז די C-טערמינאַלע רעזאָלוציע געגנטן פון פּראָטעין W און RCH זענען זייער נאָענט, אָבער נישט אין דעם ראַם פון פאָרמירן ספּעציפֿישע ינטעראַקשאַנז (פיגור 1, A און E). אָבער, עס קען זיין ינטעראַקשאַנז אין די נישט-געלייזטע C-טערמינאַלע אַמינאָ זויערן פון די צוויי פּראָטעאינען, וואָס קען צושטעלן אַ מעханіזם פֿאַר די רעקרוטמענט פון פּראָטעין-W בעת די אַסעמבלי פון די RC-LH114-W קאָמפּלעקס.
(א) פּראָטעין-W, וואָס קוקט אויף דער גרענעץ מיט LH1αβ14 אין קאַרטון פאָרעם, האט אַ שטאַנג-פאָרמיגע זייט קייט (רויט), געוויזן אין אַ טייל פון דער עלעקטראָסטאַטישער פּאָטענציעל דיאַגראַמע (דורכזיכטיקער גרויער ייבערפלאַך מיט אַ קאָנטור מדרגה פון 0.13). (ב) פּראָטעין-W רעפּרעזענטירט דורך אַ הידראָפאָביש קאָלירט ייבערפלאַך. פּאָלאַרע און געלאָדענע געביטן ווערן געוויזן אין ציאַן, הידראָפאָבישע געביטן ווערן געוויזן אין ווייס, און שטאַרק הידראָפאָבישע געביטן ווערן געוויזן אין אָראַנדזש. (C און D) פּראָטעין-W רעפּרעזענטירט אין קאַרטון, זיין אָריענטאַציע איז די זעלבע ווי אין (A) (C), און ראָטירט דורך 180° (D). לויט דער פּאָזיציע אין דער סיקוואַנס, די אונטערשיידלעכע רעזידוען נעמען אן אַ רעגנבויגן קאָליר סכעמע, וואו דער N-טערמינאַל איז בלוי און דער C-טערמינאַל איז רויט. (E) פּראָטעין-W אין דער זעלבער מיינונג ווי אין (A), און די רעזידוען ביי דער גרענעץ פון פּראָטעין-W:LH1 ווערן רעפּרעזענטירט דורך שטענגלעך מיט אַטאַטשט מאַרקס. (F) פּראָטעין-W איז ראָטירט 90° אין באַצוג צו (E) און LH1αβ14 אין דער קאַרטון רעפּרעזענטאַציע, און אין באַצוג צו די אינטערפֿייס רעזידוען אין דער באַר רעפּרעזענטאַציע. די איבערהענגיקע רעזידוען פֿון דעם ביתא פּאָליפּעפּטיד זענען באַצייכנט. דער קאָפאַקטאָר ווערט געוויזן ווי אַ באַר וואָס פּאַסט צו דער קאָליר פֿון פֿיגור 1, דער צעבראָכענער β-DDM ווערט געוויזן אין גרוי, און דער זויערשטאָף ווערט געוויזן אין רויט. (G) די אויסזיכט אין (F) איז ראָטירט 180°, מיט די פּראָמינענטע רעזידוען פֿון דעם באַצייכנטן אַלפֿאַ פּאָליפּעפּטיד.
פּראָטעין-W פֿאַרבייט אַן αβ העטעראָדימער (דער 15טער אין פֿיגור 1F), דערמיט פֿאַרהיטנדיק שלייף-פֿאַרמאַכונג און נייטיקנדיק די ערשטע דריי αβ העטעראָדימערן. מען האָט באַמערקט אַז דער מאַקסימום נייקונג-ווינקל פֿון דעם ערשטן αβ-1 העטעראָדימער אין באַצוג צו דער פֿילם-נאָרמאַל איז געווען 25° ביז 29° (פֿיגור 1, A און E), וואָס איז געשאַפֿן געוואָרן דורך דער 2° ביז 8° נייקונג פֿון αβ-1 אין RC A שאַרפֿער קאָנטראַסט-LH116 (פֿיגור 1, B און F). די צווייטע און דריטע העטעראָדימערן זענען גענייגט ביי 12° ביז 22° און 5° ביז 10°, בהתאמה. צוליב דער סטערישער שטערונג פֿון RC, נעמט די נייקונג פֿון αβ-1 נישט אַרײַן דאָס צווייטע פּאָר פֿון αβ (וואָס קאָרעספּאָנדירט צום 16טן αβ אין פֿיגור 1F), דערמיט שאַפֿנדיק אַ קלאָרע שפּאַלט אין דעם LH1 רינג (פֿיגור 1, A און E). צוליב דעם מאַנגל פון צוויי αβ העטעראָדימערן, באַגלייט מיטן פארלוסט פון פיר BChl און צוויי קאַראָטענאָידן, בינדט זיך קיינער פון די קאַראָטענאָידן נישט צו דער פארדרייטער αβ-1 סוביוניט, וואָס רעזולטירט אין אַ LH114-W רינג וואָס אנטהאלט 13 וועגעטאַרישע קאַראָטענאָידן און 28 BChls. די לאָקאַלע רעזאָלוציע שאַצונגען פון די צוויי קאָמפּלעקסן אין די αβ1 ביז 7 געגנטן זענען נידעריקער ווי די פון די רעשט פון די LH1 שלייף, וואָס קען שפּיגלען די אינהערענטע פּלאַסטיסיטי פון די LH1 סוביוניט לעבן דעם RC QB פּלאַץ (פיגור 4).
די בילדער פון RC-LH114-W (A און B) און RC-LH116 (C און D) ווערן געוויזן פון דער זעלבער אויבערשטער בליק/זייט בליק (A און B) (A און C) און קאַוואַטי ייבערפלאַך פון בילד 1. (B און D). די קאָלירטע קנעפּלעך ווערן געוויזן אויף דער רעכטער זייט.
דער איינציגער אנדערער כאַראַקטעריסטישער קערן קאָמפּלעקס מיט אַ סטאָיכיאָמעטרישן פאַרהעלטעניש פון 1:14 איז דער Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX דימער (13). אָבער, פּראָטעין W און PufX האָבן נישט קיין קלאָרע האָמאָלאָגיע, און האָבן אַ באַדייטנדיקן השפּעה אויף זייערע ריספּעקטיווע LH1 סטרוקטורן. PufX איז אַן איינציקער TMH מיט אַן N-טערמינאַל ציטאָפּלאַזמישער דאָמעין וואָס אינטעראַקטירט מיט דער ציטאָפּלאַזמישער זייט פון דער RC-H סוביוניט (13) אין אַ פּאָזיציע וואָס קאָרעספּאָנדירט צו Rps. palustris LH116αβ-16. PufX שאַפט אַ קאַנאַל פֿאַר דעם קווינאָן/קווינאָלאָן אויסטויש צווישן RC-LH1 און דעם ציטאָכראָם bcl קאָמפּלעקס און איז פאַראַן אין אַלע Rba. sphaeroides קערן קאָמפּלעקס (13). כאָטש די מאָנאָמער-מאָנאָמער אינטערפאַס איז אין Rba. דער ספאראיידעס RC-LH1-PufX דימער געפינט זיך ביי דער בינדונג פאזיציע פון ​​פראטעין W אין RC-LH114-W, און די ריס וואס ווערט אינדוצירט דורך PufX און פראטעין-W איז ביי אן עקוויוואלענטער פאזיציע (פיגור S7A). די ריס אין RC-LH114-W איז אויך אויסגעשטעלט מיטן היפאטעטישן קווינאן קאנאל (8) פון Pseudomonas rosea LH1, וואס ווערט געשאפן דורך פעפטיידן וואס זענען נישט פארבונדן מיט פראטעין W אדער PufX (פיגור S7B). דערצו, דער קווינאן קאנאל אין Blc. דער שמאראגד גרינער LH1 געשאפן דורך אויסשליסן איין γ סוביוניט (7) געפינט זיך אין א ענליכער פאזיציע (פיגור S7C). כאטש פארמיטלט דורך פארשידענע פראטעאינען, די אויסזעהן פון די קווינאן/קווינאלאל קאנאלן אין א געמיינזאמער פאזיציע אין דעם RC-LH1 קאמפלעקס שיינט צו זיין א ביישפיל פון קאנווערגענטער עוואלוציע, וואס ווייזט אז די ריס וואס ווערט באשאפן דורך פראטעין W קען דינען אלס א קווינאן קאנאל.
דער שפּאַלט אין דער LH114-W שלייף ערלויבט די פאָרמירונג פון אַ קאָנטינויִערלעכער מעמבראַנע געגנט צווישן דעם אינערלעכן פּלאַץ פון דעם RC-LH114-W קאָמפּלעקס און דעם גרויסן מעמבראַנע (פיגור 1G), אַנשטאָט צו פאַרבינדן די צוויי דאָמעינען דורך אַ פּראָטעין פּאָרע ווי אין פּראָטעאינען. דער RC-LH116 קאָמפּלעקס איז ענלעך צו אַ פֿאַרמאַכטן Tch. נאָדל-ווי קאָמפּלעקס (22) (פיגור 1H). זינט די דיפוזיע פון ​​קווינאָן דורך דער מעמבראַנע איז שנעלער ווי די דיפוזיע דורך דעם שמאָלן פּראָטעין קאַנאַל, קען דער אָפֿענער LH114-W שלייף ערלויבן אַ שנעלערן RC וועקסל ווי דער פֿאַרמאַכטער LH116 שלייף, און די דיפוזיע פון ​​קווינאָן אין דעם RC קען זיין מער באַגרענעצט. כּדי צו פּרובירן צי פּראָטעין W אַפֿעקטירט די קאָנווערסיע פון ​​קווינאָנען דורך RC, האָבן מיר דורכגעפֿירט אַ ציטאָכראָם אָקסידאַציע אַסיי אויף אַ געוויסער קאָנצענטראַציע פון ​​יוביקווינאָן 2 (UQ2) (אַן אַנאַלאָג פון נאַטירלעכן UQ10 מיט אַ קירצערן איזאָפּרען עק) (פיגור 2E). כאָטש די אנוועזנהייט פון כעלאַטעד קווינאָנע שטערט די פּינקטלעכע באַשטימונג פון דער אויסזעענדיקער מיכאעליס קאָנסטאַנט (RC-LH114-W און RC-LH116 זענען פּאַסיק פֿאַר 0.2±0.1μM און 0.5±0.2μM, ריספּעקטיוולי), איז די מאַקסימום ראַטע פון ​​RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5% גרעסער ווי RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
מיר האָבן אָנהייב געשאַצט אַז פּראָטעין-W איז פאַראַן אין בערך 10% פֿון דעם קערן קאָמפּלעקס (16); דאָ זענען די באַזעצונג ראַטעס פֿון נידעריק-ליכט, מיטל-ליכט, און הויך-ליכט וואוקס צעלן 15±0.6%, 11±1% און 0.9±0.5, ריספּעקטיוולי % (פֿיגור 2F). קוואַנטיטאַטיווער פֿאַרגלייַך פֿון מאַסע ספּעקטראָמעטריע האָט געוויזן אַז די צוגאב פֿון היסטידין טאַג האָט נישט פֿאַרקלענערט די רעלאַטיווע פֿילקייט פֿון פּראָטעין-W קאַמפּערד צו ווילד-טיפּ שטאַמען (P = 0.59), אַזוי די לעוועלס זענען נישט אַן אַרטיפאַקט פֿון מאָדיפֿיצירט פּראָטעין-W (פֿיגור S10). אָבער, די נידעריקע באַזעצונג פֿון פּראָטעין-W אין דעם RC-LH1 קאָמפּלעקס קען דערלויבן עטלעכע RCs צו פֿליפּן מיט אַ אַקסעלערירטן קורס, דערמיט פֿאַרמינדערנדיק דעם שטייטערן קווינאָנע/קווינאָלאָנע אויסטויש אין דעם RC-LH116 קאָמפּלעקס. מיר האָבן באַמערקט אַז די הויך ליכט באַזעצונג קורס איז נישט קאָנסיסטענט מיט די לעצטע טראַנסקריפּטאָמיקס דאַטן, וואָס ווײַזט אַז pufW דזשין אויסדרוק פֿאַרגרעסערט זיך אונטער שטאַרק ליכט (פֿיגור S11) (23). דער אונטערשייד צווישן pufW טראַנסקריפּציע און פּראָטעין-W אינקאָרפּאָראַציע אין די RC-LH1 קאָמפּלעקס איז פֿאַרווירענדיק און קען שפּיגלען די קאָמפּלעקסע רעגולאַציע פֿון דעם פּראָטעין.
אין RC-LH114-W, 6 קאַרדיאָליפּין (CDL), 7 פאָספאַטידילטשאָלין (POPC), 1 פאָספאַטידילגליסעראָל (POPG) און 29 β-DDM מאָלעקולן זענען אַלאָקירט און מאָדעלירט אין אים 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs און 12 βDDMs. RC-LH116 (פיגור 5, A און B). אין די צוויי סטרוקטורן, איז CDL כּמעט ליגן אויף דער ציטאָפּלאַזמישער זייט פון דעם קאָמפּלעקס, בשעת POPC, POPG און β-DDM זענען מערסטנס ליגן אויף דער לומינאַלער זייט. צוויי ליפּיד און דיטערדזשענט מאָלעקולן זענען אפגעזונדערט געוואָרן אין דער αβ-1 ביז αβ-6 געגנט פון דעם RC-LH114-W קאָמפּלעקס (פיגור 5A), און פינף זענען אפגעזונדערט געוואָרן אין דער עקוויוואַלענטער געגנט פון RC-LH116 (פיגור 5B). מער ליפּידן זענען געפונען געוואָרן אויף דער אַנדערער זײַט פֿון דעם קאָמפּלעקס, הויפּטזעכלעך CDL, וואָס האָבן זיך אָנגעזאַמלט צווישן RC און αβ-7 ביז αβ-13 (פֿיגור 5, A און B). אַנדערע סטרוקטורעל אויפֿגעלייזטע ליפּידן און דיטערדזשענטן געפֿינען זיך אַרויס פֿונעם LH1 רינג, און גוט אויפֿגעלייזטע אַציל קייטן פֿאַרלענגערן זיך צווישן LH1 סוביוניטן, פֿאָרויסזאָגער באַצייכנט ווי β-DDM אין RC-LH114-W, און דעפֿינירט ווי β-DDM אין RC. אַ געמיש פֿון β-DDM און POPC-LH116. די ענלעכע פּאָזיציעס פֿון כעלאַטינג ליפּידן און דיטערדזשענטן אין אונדזער סטרוקטור ווײַזן אָן אַז זיי זענען פֿיזיאָלאָגיש באַטייַטיקע בינדונג ערטער (פֿיגור S12A). די פּאָזיציעס פֿון עקוויוואַלענטע מאָלעקולן אין Tch האָבן אויך גוטע קאָנסיסטענץ. Gentle און Trv. שטאַם 970 RC-LH1s (פיגור S12, B ביז E) (9, 12) און די הידראָגען-בונדינג רעזידוען פון דער ליפּיד קאָפּ גרופּע האָבן געוויזן גאַנץ גוטע קאָנסערוואַציע אין דער סיקוואַנס אַליינמענט (פיגור S13), וואָס ווײַזט אַז קאָנסערווירטע CDL וואָס בינדט זיך צו RC (24), די זייטלעך קענען זײַן קאָנסערווירט אין דעם RC-LH1 קאָמפּלעקס.
(A און B) RC-LH114-W (A) און RC-LH116 (B) פּעפּטיידן ווערן רעפּרעזענטירט דורך קאַרטאָאָנס, און די פּיגמענטן ווערן רעפּרעזענטירט דורך שטאַנגען, ניצנדיק די קאָליר סכעמע אין פיגור 1. ליפּידן ווערן געוויזן אין רויט, און דיטערדזשענץ ווערן געוויזן אין גרוי. UQ געבונדן צו RC QA און QB זייטלעך איז געל, בשעת אפגעזונדערטע UQ איז בלוי. (C און D) די זעלבע קוקן ווי (A) און (B), מיט ליפּידן אויסגעלאָזט. (E צו G) פאַרגרעסערטע קוק פון Q1(E), Q2(F) און Q3(G) פון RC-LH116, מיט זייט קייטן וואָס השפּעה האָבן איינער אויף די אַנדערע. די הידראָגען בונדן ווערן געוויזן ווי שוואַרצע געשטריכלטע ליניעס.
אין RC-LH116, ווערן ביידע RC QA און QB UQ, וועלכע נעמען אנטייל אין עלעקטראן טראנספער אין דעם לאדונג צעשיידונג פראצעס, צעבראכן אין זייערע בינדונג זייטלעך. אבער, אין RC-LH114-W, איז QB קווינאן נישט געווארן אויפגעלייזט און וועט ווערן דיסקוטירט אין דעטאל ווייטער. אין צוגאב צו QA און QB קווינאָנען, ווערן צוויי כעלירטע UQ מאלעקולן (געפינען זיך צווישן די RC און LH1 רינגען) צוגעטיילט אין דער RC-LH114-W סטרוקטור לויט זייערע גוט-אויסגעלייזטע קאפ גרופעס (געפינען זיך אין Q1 און Q2, בהתאמה). (פיגור 5C). צוויי איזאפרען איינהייטן ווערן צוגעטיילט צו Q1, און די געדיכטקייט מאפע אויפלעזט די גאנצע 10 איזאפרען עקן פון Q2. אין דער סטרוקטור פון RC-LH116, זענען דריי כעלירטע UQ10 מאלעקולן (Q1 ביז Q3, פיגור 5D) געווארן אויפגעלייזט, און אלע מאלעקולן האבן א קלארע געדיכטקייט איבערן גאנצן עק (פיגור 5, D ביז G). אין די צוויי סטרוקטורן, די פאזיציעס פון די כינאון קאפ גרופעס פון Q1 און Q2 האבן אן אויסגעצייכנטע קאנסיסטענסי (פיגור S12F), און זיי אינטעראקטירן נאר מיט RC. Q1 געפינט זיך ביים אריינגאנג פון די W שפאלט פון RC-LH114-W (פיגור 1G און 5, C, D און E), און Q2 געפינט זיך לעבן דעם QB בינדינג ארט (פיגור 5, C, D) און F). די קאנסערווירטע L-Trp143 און L-Trp269 רעזידוען זענען זייער נאנט צו Q1 און Q2 און צושטעלן פאטענציעלע π-סטאַקינג אינטעראקציעס (פיגור 5, E און F, און פיגור S12). L-Gln88, 3.0 Å פון די דיסטאלע זויערשטאף פון Q1, צושטעלט א שטארקע וואסערשטאף בונד (פיגור 5E); די רעזידו איז קאנסערווירט אין אלע RCs אחוץ די ווייטסטע באציאונג (פיגור S13). L-Ser91 ווערט קאנסערוואטיוו סובסטיטוטירט פאר Thr אין רוב אנדערע RCs (פיגור S13), איז 3.8 אנגסטראם פון דעם מעטיל זויערשטאף פון Q1, און קען צושטעלן שוואכע וואסערשטאף בונדן (פיגור 5E). Q3 שיינט נישט צו האבן א ספעציפישע אינטעראקציע, אבער געפינט זיך אין דער הידראפאבישער ראיאן צווישן דעם RC-M סוביוניט און דעם LH1-α סוביוניט 5 ביז 6 (פיגור 5, D און G). Q1, Q2 און Q3 אדער נאנטע כעלירטע קווינאָנעס זענען אויך געווארן אפגעזאגט אין Tch. Gentle, Trv. Strain 970 און Blc. די איריס סטרוקטור (9, 10, 12) ווייזט אויף א קאנסערווירט הילפס-קווינאָן בינדינג ארט אין דעם RC-LH1 קאמפלעקס (פיגור S12G). די פינף צעפאלענע UQs אין RC-LH116 זענען אין גוטער הסכמה מיט די 5.8±0.7 פון יעדן קאמפלעקס באשטימט דורך הויך-פארשטעלונג פליסיק כראמאטאגראפיע (HPLC), בשעת די דריי צעפאלענע UQs אין RC-LH114-W זענען נידעריגער ווי דער געמאסטענער ווערט פון 6.2±0.3 (פיגור S14) ווייזט אז עס זענען דא אומגעלייזטע UQ מאלעקולן אין דער סטרוקטור.
די פּסעוודאָ-סימעטרישע L און M פּאָליפּעפּטידן אַנטהאַלטן יעדער פינף TMHs און פֿאָרמען אַ העטעראָדימער וואָס קאָמבינירט איין BChl דימער, צוויי BChl מאָנאָמערן, צוויי באַקטעריאָפֿאַג (BPh) מאָנאָמערן, און איין ניט-העמע אייַזן און איין אָדער צוויי UQ10 מאָלעקולן. דורך דער בייַזייַן פֿון וואַסערשטאָף בונדן אויף דער טערמינאַלער קעטאָן גרופּע און איר באַקאַנטער אַקומולאַציע אין Rps, ווערן קאַראָטענאָידן אײַנגעאַרבעט אין דער M-סוביוניט, וואָס הייסט cis-3,4-dehydroorhodopin. מינים (25). די אויסערלעכע מעמבראַן דאָמעין פֿון RC-H איז פֿאַראַנקערט צו דער מעמבראַן דורך איין TMH. די אַלגעמיינע RC סטרוקטור איז ענלעך צו די דריי סוביוניט RC פֿון פֿאַרבונדענע מינים (ווי Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). די מאַקראָציקלען פֿון BChl און BPh, די קאַראָטענאָיד באַקבאָון און ניט-העמע אייַזן איבערלאַפּן זיך אין דער רעזאָלוציע ראַנגע פֿון די סטרוקטורן, ווי אויך די UQ10 קאָפּ גרופּע בײַם QA אָרט און די QB קווינאָנע בײַ RC-LH116 (פֿיגור S15).
די פארהאן-זיין פון צוויי RC סטרוקטורן מיט פארשידענע QB זייטל באזעצן ראטעס גיט א נייע געלעגנהייט צו אויספארשן די קאנסיסטענטע קאנפארמאציאנעלע ענדערונגען וואס באגלייטן QB קווינאן בינדונג. אין דעם RC-LH116 קאמפלעקס, איז QB קווינאן לאקירט אין דער פולשטענדיג געבונדענער "פראקסימאלער" פאזיציע (26), אבער די צעשיידונג פון RC-LH114-W האט נישט QB קווינאן. עס איז נישטא קיין QB קווינאן אין RC-LH114-W, וואס איז איבעראשנד ווייל דער קאמפלעקס איז אקטיוו, מער ווי דער RC-LH116 קאמפלעקס מיט סטרוקטורעל אויפגעלייזטן QB קווינאן. כאטש די צוויי LH1 רינגען כעלירן בערך זעקס קווינאנעס, זענען פינף סטרוקטורעל אויפגעלייזט אין דעם פארמאכטן RC-LH116 רינג, בשעת נאר דריי זענען סטרוקטורעל באגרענעצט אין דעם אפענעם RC-LH114-W רינג. די פארגרעסערטע סטרוקטורעלע אומארדנונג קען שפיגלען די שנעלערע אויסטויש פון RC-LH114-W QB זייטן, שנעלערע קווינאן קינעטיק אין דעם קאמפלעקס, און פארגרעסערטע מעגלעכקייט פון אריבערגיין דעם LH1 שלייף. מיר פֿאָרשלאָגן אַז דער מאַנגל פֿון UQ אין דעם RC QB אָרט פֿון RC-LH114-W קען זײַן דער רעזולטאַט פֿון אַ מער קאָמפּליצירטן און מער אַקטיוון קאָמפּלעקס, און דער QB אָרט פֿון RC-LH114-W איז באַלד פֿאַרפֿרוירן געוואָרן אין UQ טורנאָוווער. די ספּעציפֿישע בינע (דער אַרײַנגאַנג צום QB אָרט איז פֿאַרמאַכט געוואָרן) שפּיגלט אָפּ די קאָנפֿאָרמאַציע פֿון דער אַקטיוויטעט.
אָן QB, די באַגלייטנדיקע ראָטאַציע פון ​​L-Phe217 צו אַ פּאָזיציע וואָס איז נישט קאָמפּאַטיבל מיט UQ10 ביינדינג, ווייַל עס וועט פאַראורזאַכן אַ ספּיישאַל קאָליזיע מיט דער ערשטער איזאָפּרענע אַפּאַראַט פון די עק (פיגור 6A). אין דערצו, די קלאָרע הויפּט קאָנפאָרמאַציאָנעלע ענדערונגען זענען קלאָר, ספּעציעל די העליקס דע (קורצע העליקס אין די שלייף צווישן TMH D און E) וווּ L-Phe217 איז גערוקט צו די QB ביינדינג טאַש און די ראָטאַציע פון ​​L-Tyr223 (פיגור 6A) צו ברעכן די הידראָגען בונד מיט די M-Asp45 ראַם און פאַרמאַכן דעם אַרייַנגאַנג פון די QB ביינדינג פּלאַץ (פיגור 6B). העליקס דע דרייט זיך ביי זיין באַזע, די Cα פון L-Ser209 איז גערוקט מיט 0.33 Å, בשעת די L-Val221Cα איז גערוקט מיט 3.52 Å. עס זענען קיין אָבסערוואַבלע ענדערונגען אין TMH D און E, וואָס זענען סופּעראַמפּאָוזאַבאַל אין ביידע סטרוקטורן (פיגור 6A). אזוי ווייט ווי מיר ווייסן, איז דאס די ערשטע סטרוקטור אין דעם נאטירלעכן RC וואס פארמאכט דעם QB ארט. א פארגלייך מיט דער גאנצער (QB-געבונדענער) סטרוקטור ווייזט אז איידער דער קווינאן ווערט רעדוצירט, איז א קאנפארמאציאנעלע ענדערונג נויטיג כדי עס זאל אריינגיין אין דעם קווינאן. L-Phe217 דרייט זיך צו פארמירן א π-סטאַקינג אינטעראקציע מיט דער קווינאן קאפ גרופע, און די העליקס פארשיבט זיך ארויס, ערלויבנדיג דעם סקעלעט פון L-Gly222 און די זייט קייט פון L-Tyr223 צו פארמירן א וואסערשטאף בונד נעץ מיט א סטאביליער וואסערשטאף בונד סטרוקטור (פיגור 6, A און C).
(א) איבערלאַפּנדיקע קאַרטון פון האָלאָגראַם (L קייט, אָראַנדזש/M קייט, מאַגענטאַ) און אַפּאָ (גרוי) סטרוקטור, אין וועלכער די שליסל רעזידוען ווערן געוויזן אין דער פאָרעם פון אַ שטאַנג-ווי רעפּרעזענטאַציע. UQ10 ווערט רעפּרעזענטירט דורך אַ געלן באַר. די פּונקטירטע ליניע ווייזט די וואַסערשטאָף בונדן געשאפן אין דער גאַנצער סטרוקטור. (ב און ג) די ייבערפלאַך רעפּרעזענטאַציע פון ​​דעם אַפּאָליפּאָפּראָטעין און דער גאַנצער רינג סטרוקטור, וואָס הויכפּונקטן דעם זייט קייט זויערשטאָף פון L-Phe217 אין בלוי און L-Tyr223 אין רויט, ריספּעקטיוולי. די L סוביוניט איז אָראַנדזש; די M און H סוביוניטס זענען נישט קאָלירט. (ד און ה) אַפּאָליפּאָפּראָטעין (ד) און גאַנצע (ה) RC QB זייטלעך [קאָלירט דורך (א) ריספּעקטיוולי] און טערמאָפילוס טערמאָפילוס PSII (גרין, בלוי מיט פּלאַסטיק קווינאָנע; PDB ID: 3WU2) אַליינמענט (58).
אומגעריכט, כאָטש עטלעכע סטרוקטורן פון QB-דעפיציענט RCs אָן LH1 זענען פאַראַן, די קאָנפאָרמאַציאָנעלע ענדערונגען וואָס זענען באמערקט געוואָרן אין דעם לערנען זענען נישט פריער געמאלדן געוואָרן. די אַרייַננעמען די QB דיפּלישאַן סטרוקטור פון Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) און Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), אַלע פון ​​​​וואָס זענען כּמעט די זעלבע ווי זייער קוילעלדיק QB סטרוקטור. אַ נאָענטע דורכקוק פון 3PRC האט געוויזן אַז LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) דיטערדזשענט מאַלאַקיולן בינדן זיך ביים אַרייַנגאַנג פון דער QB פּאָזיציע, וואָס קען פאַרהיטן ריעריינדזשמאַנט אין אַ פארמאכט קאָנפאָרמאַציע. כאָטש LDAO צעפאַלט נישט אין דער זעלביקער פּאָזיציע אין 1EYS אָדער 1OGV, די RCs זענען צוגעגרייט מיט דעם זעלבן דיטערדזשענט און קענען דעריבער פּראָדוצירן דעם זעלבן ווירקונג. די קריסטאַל סטרוקטור פון Rba. ספאראיידעס RC קא-קריסטאליזירט מיט ציטאכראם c2 (PDB ID: 1L9B) שיינט אויך צו האבן א פארמאכטן QB ארט. אבער, אין דעם פאל, נעמט די N-טערמינאלע ראיאן פון די RC-M פאליפעדיט (וואס אינטעראקטירט מיטן QB בינדינג ארט דורך די H בונד פון די טיר רעזידו אויף די Q העליקס) אן אן אומנאטירלעכע קאנפארמאציע, און די QB קאנפארמאציאנאלע ענדערונג ווערט נישט ווייטער אויסגעפארשט (30). וואס איז בארואיגנד איז אז מיר האבן נישט געזען אזא סארט דעפארמאציע פון ​​די M פאליפעדיט אין די RC-LH114-W סטרוקטור, וואס איז כמעט די זעלבע ווי די N-טערמינאלע ראיאן פון RC-LH116 RC. עס זאל אויך באמערקט ווערן אז נאך די אויסראטן פון די דיטערדזשענט-באזירטע LH1 אנטענע, זענען די אפאליפאפראטעין RCs אין די PDB אויפגעלייזט געווארן, וואס האט עלימינירט די אינערליכע קווינאן בעקן און ליפידן אין די שפאלט צווישן די RC און די אינערליכע אייבערפלאך פון די ארומיגע LH1 רינג (31, 32). RC בלייבט פונקציאָנעל ווייל עס האַלט אָן אַלע קאָפאַקטאָרן, אַחוץ דעם צעפאַלבאַרן QB קווינאָן, וואָס איז ווייניקער סטאַביל און ווערט אָפט פאַרלוירן בעת ​​דעם צוגרייטונג פּראָצעס (33). דערצו, איז באַקאַנט אַז די באַזייַטיקונג פון LH1 און נאַטירלעכע ציקלישע ליפּידן פון RC קען האָבן אַן השפּעה אויף פונקציעס, אַזאַ ווי די פאַרקירצטע לעבן פון דעם אָפּצאָל-געטיילטן P+QB-צושטאַנד (31, 34, 35). דעריבער, ספּעקולירן מיר אַז די עקזיסטענץ פון דעם לאָקאַלן LH1 רינג אַרום דעם RC קען האַלטן דעם "פאַרמאַכטן" QB פּלאַץ, דערמיט פּרעזערווירן די לאָקאַלע סביבה לעבן דעם QB.
כאָטש אַפּאָליפּאָפּראָטעין (אָן QB קווינאָן) און די גאַנצע סטרוקטור רעפּרעזענטירן בלויז צוויי בילדער פון דעם וועקסל פון דעם QB פּלאַץ, אַנשטאָט אַ סעריע פון ​​געשעענישן, זענען דאָ אָנצייגונגען אַז די בינדונג קען ווערן געיטעד צו פאַרהיטן ווידער-בינדונג דורך הידראָקווינאָן צו פאַרהיטן סאַבסטראַט אינהיביציע. די ינטעראַקציע פון ​​קווינאָלאָל און קווינאָן לעבן דעם QB פּלאַץ פון אַפּאָליפּאָפּראָטעין קען זיין אַנדערש, וואָס פירט צו זיין אָפּוואַרפן דורך RC. עס איז לאַנג געווען פארגעלייגט אַז קאָנפאָרמאַציאָנעלע ענדערונגען שפּילן אַ ראָלע אין דער בינדונג און רעדוקציע פון ​​קווינאָנעס. די פיייקייט פון פאַרפרוירענע RCs צו רעדוצירן קווינאָנעס נאָך טונקל אַדאַפּטיישאַן איז ימפּערד (36); X-שטראַל קריסטאַלאָגראַפי ווייזט אַז דעם שעדיקן איז רעכט צו QB קווינאָנעס זייַענדיק טראַפּט אין אַ "דיסטאַל" קאָנפאָרמאַציע וועגן 4.5 Å פון דער אַקטיווער פּראָקסימאַל שטעלע (26), 37). מיר פֿאָרשלאָגן אַז דעם דיסטאַל בינדונג קאָנפאָרמאַציע איז אַ בילד פון דעם ינטערמידייט שטאַט צווישן אַפּאָליפּאָפּראָטעין און די גאַנצע רינג סטרוקטור, וואָס גייט נאָך דער ערשטער ינטעראַקציע מיט קווינאָן און די עפענונג פון דעם QB פּלאַץ.
דער טיפ II RC וואָס מען געפינט אין דעם PSII קאָמפּלעקס פון געוויסע פאָטאָטראָפֿישע באַקטעריעס און ציאַנאָבאַקטעריעס, אַלדזשי און פלאַנצן האָט סטרוקטורעלע און פֿונקציאָנעלע קאָנסערוואַציע (38). די סטרוקטורעלע אויסריכטונג וואָס ווערט געוויזן אין פֿיגור 6 (D און E) אונטערשטרייכט די ענלעכקייט צווישן PSII RCs און דעם QB אָרט פֿון דעם באַקטיריעלן RC קאָמפּלעקס. דער פֿאַרגלייך איז שוין לאַנג געווען אַ מאָדעל פֿאַר שטודירן די נאָענט פֿאַרבונדענע סיסטעמען פֿון קווינאָן בינדונג און רעדוקציע. פֿריִערדיקע פּובליקאַציעס האָבן פֿאָרגעשלאָגן אַז קאָנפֿאָרמאַציאָנעלע ענדערונגען ווערן באַגלייט דורך PSII רעדוקציע פֿון קווינאָנען (39, 40). דעריבער, באַטראַכטנדיק די עוואָלוציאָנערע קאָנסערוואַציע פֿון RC, קען דער פֿריִער נישט באַאָבאַכטער בינדונג מעקאַניזם אויך זיין אָנווענדלעך צום QB אָרט פֿון PSII RC אין זויערשטאָף-געגעבענע פאָטאָטראָפֿישע פלאַנצן.
Rps ΔpufW (אומגעצייכנט pufW אויסמעקונג) און PufW-His (C-טערמינאל 10x His-געצייכנט פּראָטעין-W אויסגעדריקט פון די נאַטירלעכע pufW לאָקוס) שטאַמען. palustris CGA009 איז געווען באַשריבן אין אונדזער פריערדיקער אַרבעט (16). די שטאַמען און די איזאָגענישע ווילד-טיפּ עלטערן זענען צוריקגעכאפט געוואָרן פון די פריזער דורך אויסשטרעקן אַ קליינע צאָל צעלן אויף PYE (יעדער 5 ג ליטער -1) (געהיט אין LB ​​ביי -80 °C, מיט 50% (w/v) גליסעראָל) פּראָטעין, הייוון עקסטראַקט און סוקסינאַט) אַגאַר [1.5% (w/v)] טעלער. די טעלער איז געווען אינקובירט איבערנאכט אין דער פינצטער ביי צימער טעמפּעראַטור אונטער אַנעראָובישע באדינגונגען, און דערנאָך באַלויכטן מיט ווייס ליכט (~50 μmolm-2 s-1) צוגעשטעלט דורך OSRAM 116-W האַלאָגען באַלבז (RS Components, UK) פֿאַר 3 ביז 5 טעג ביז אַן איינציקע קאָלאָניע איז דערשינען. איין קאלאניע איז גענוצט געווארן צו אינאקולירן 10 מל פון M22+ מעדיום (41) סופּלעמענטירט מיט 0.1% (w/v) קאַסאַמינאָ זויערן (ווייטער באצייכנט אלס M22). די קולטור איז געוואקסן אונטער נידריגע זויערשטאָף באדינגונגען אין דער פינצטער ביי 34°C מיט שאקלען ביי 180 rpm פאר 48 שעה, און דערנאך איז 70 מל פון דער קולטור אינאקולירט געווארן אונטער די זעלבע באדינגונגען פאר 24 שעה. א האַלב-אַעראָבישע קולטור מיט א וואָלומען פון 1 מל ווערט גענוצט צו אינאקולירן 30 מל פון M22 מעדיום אין א 30 מל אוניווערסאַלער שרויף-דעקל טראַנספּאַרענט גלאז פלאַש און באַשטראַלט מיט אַדזשאַטיישאַן (~50μmolm-2 s-1) פאר 48 שעה מיט א סטערילע מאַגנעטישע קראַפט רירשטאַנג. דערנאך איז 30 מל פון דער קולטור אינאקולירט געווארן מיט בערך 1 ליטער קולטור אונטער די זעלבע באדינגונגען, וואָס איז דערנאך גענוצט געווארן צו אינאקולירן בערך 9 ליטער קולטור באלויכטן ביי ~200 μmolm-2 s-1 פאר 72 שעה. די צעלן זענען געזאמלט געוואָרן דורך צענטריפוגאַציע ביי 7132 RCF פֿאַר 30 מינוט, ווידער סוספּענדירט אין ~10 מל פון 20 mM טריס-HCl (pH 8.0), און געהאַלטן ביי -20°C ביז זיי זענען געברויכט געוואָרן.
נאך אויפטויען, לייגט צו עטלעכע קריסטאלן פון דעאקסיריבאנוקלעאז I (מערק, פאראייניגטע קעניגרייך), ליזאזיים (מערק, פאראייניגטע קעניגרייך) און צוויי ראָוש האָלאָענזיים פּראָטעאַזע אינהיביטאָר טאַבלעטן (מערק, פאראייניגטע קעניגרייך) צו די ווידער-אויסגעלייגטע צעלן. אין א 20,000 פּסי פראנצויזיש דרוק צעל (אַמינקאָ, USA), זענען די צעלן צעשטערט געוואָרן 8 ביז 12 מאָל. נאך ארויסנעמען אומגעבראָכענע צעלן און נישט-אויפלעזלעכע רעשטלעך דורך צענטריפוגאַציע ביי 18,500 RCF פאר 15 מינוט ביי 4°C, איז די מעמבראַן אויסגעפּרעסיפּיטירט געוואָרן פון דעם פּיגמענטירטן ליזאַט דורך צענטריפוגאַציע ביי 113,000 RCF פאר 2 שעה ביי 43,000°C. וואַרפט אַוועק די אויפגעלייזלעכע פראַקציע און ווידער-אויפלעסט די קאָלירטע מעמבראַן אין 100 ביז 200 מל פון 20 mM טריס-HCl (pH 8.0) און האָמאָגעניזירט ביז עס זענען נישטאָ קיין זעבארע אַגראַגאַטן. די סוספּענדירטע מעמבראַנע איז אינקובירט געוואָרן אין 20 mM טריס-HCl (pH 8.0) (אַנאַטרייס, USA) מיט 2% (w/v) β-DDM פֿאַר 1 שעה אין דער פֿינצטערניש ביי 4°C מיט אַ זאַפֿטיקן רירן. דערנאָך סענטריפוגירט ביי 70°C צו צעלאָזן 150,000 RCF ביי 4°C פֿאַר 1 שעה צו באַזײַטיקן רעשטלעך פֿון נישט-צעלאָזלעכע מאַטעריאַלן.
די סאָלוביליזירנדיקע מעמבראַנע פֿון דעם ΔpufW שטאַם איז געווען אַפּליצירט צו אַ 50 מל DEAE סעפֿאַראָז יאָן אויסטויש קאָלום מיט דריי קאָלום וואַליומז (CV) פֿון ביינדינג באַפֿער [20 mM טריס-HCl (pH 8.0) וואָס ענטהאַלט 0.03% (w / v) β-DDM]. וואַשט די קאָלום מיט צוויי CV ביינדינג באַפֿערס, און דערנאָך וואַשט די קאָלום מיט צוויי ביינדינג באַפֿערס וואָס ענטהאַלטן 50 mM NaCl. דער RC-LH116 קאָמפּלעקס איז געווען עלוטירט מיט אַ לינעאַר גראַדיענט פֿון 150 ביז 300 mM NaCl (אין ביינדינג באַפֿער) אויף 1.75 CV, און דער איבעריקער ביינדינג קאָמפּלעקס איז געווען עלוטירט מיט אַ ביינדינג באַפֿער וואָס ענטהאַלט 300 mM NaCl אויף 0.5 CV. זאַמלט דעם אַבזאָרפּציע ספּעקטרום צווישן 250 און 1000 נאַנאָמעטער, האַלט די פראַקציע מיט אַ אַבזאָרבאַנס פאַרהעלטעניש (A880/A280) גרעסער ווי 1 ביי 880 ביז 280 נאַנאָמעטער, פֿאַרדיןנט עס צוויי מאָל אין דעם ביינדינג באַפער, און ניצט די זעלבע פּראָצעדור ווידער אויף דער DEAE קאָלום ביי רייניקונג. פֿאַרדיןנט די פראַקציעס מיט A880/A280 פאַרהעלטענישן העכער ווי 1.7 און A880/A805 פאַרהעלטענישן העכער ווי 3.0, דורכפירט די דריטע רונדע פון ​​יאָן וועקסל, און האַלט פראַקציעס מיט A880/A280 פאַרהעלטענישן העכער ווי 2.2 און A880/A805 פאַרהעלטענישן העכער ווי 5.0. דער טיילווייז גערייניקטער קאָמפּלעקס איז קאָנצענטרירט געוואָרן צו ~2 מל אין אַן Amicon 100,000 מאָלעקולאַר וואָג קאַט-אָף (MWCO) צענטריפוגאַל פילטער (Merck, פֿאַראייניקטע קעניגרייך), און אַריינגעלאָדן אויף אַ Superdex 200 16/600 גרייס אויסשליסונג קאָלום (GE Healthcare, USA) וואָס האָט ענטהאַלטן 200 mM NaCl באַפער, און דערנאָך עלוטירט אין דעם זעלבן באַפער ביי 1.5 CV. זאַמלט די אַבזאָרפּציע ספּעקטראַ פון דער גרייס אויסשליסונג פראַקציע, און קאָנצענטרירט די אַבזאָרפּציע ספּעקטראַ מיט A880/A280 פאַרהעלטענישן איבער 2.4 און A880/A805 פאַרהעלטענישן איבער 5.8 ביז 100 A880, און ניצט זיי גלייך פֿאַר קריאָ-TEM גריד צוגרייטונג אָדער סטאָרידזש. האַלט ביי -80°C ביז נויטיק.
די סאָלוביליזירנדיקע מעמבראַנע פֿון PufW-His שטאַם איז געווען אַפּליצירט צו אַ 20 מל HisPrep FF Ni-NTA Sepharose קאָלום (20 mM tris-HCl (pH 8.0) מיט 200 mM NaCl און 0.03% (w/w)) אין IMAC באַפֿער (GE Healthcare). (v) β-DDM]. די קאָלום איז געוואַשן געוואָרן מיט פֿינף CVs פֿון IMAC באַפֿער, און דערנאָך מיט פֿינף CVs פֿון IMAC באַפֿער מיט 10 mM היסטידין. דער קערן קאָמפּלעקס איז געווען עלוטירט פֿון דער קאָלום מיט פֿינף IMAC באַפֿערס מיט 100 mM היסטידין. די פֿראַקציע מיט דעם RC-LH114-W קאָמפּלעקס איז קאָנצענטרירט צו ~10 מל אין אַ געמישטן טאַנק אויסגעשטאַט מיט אַן Amicon 100,000 MWCO פֿילטער (Merck, UK), פֿאַרדיןנט 20 מאָל מיט ביינדינג באַפֿער, און דערנאָך צוגעגעבן צו 25 מל. אין דער DEAE Sepharose קאָלום, ווערן פֿיר CVs געבונדן צום באַפֿער געניצט אין פֿאָרויס. וואַשט די קאָלום מיט פיר CV בינדינג בופערס, דערנאָך עלוטירט דעם קאָמפּלעקס אויף אַכט CVs אויף אַ לינעאַרן גראַדיענט פון 0 ביז 100 mM NaCl (אין בינדינג בופער), און די איבעריקע פיר CVs מיט 100 mM בינדינג בופער. די רעשט קאָמפּלעקסן וואָס זענען עלוטירט אויף דעם נאַטריום קלאָריד קאַמביינד מיט דעם A880/A280 פאַרהעלטעניש העכער ווי 2.4 און דעם A880/A805 פאַרהעלטעניש העכער ווי 4.6 פראַקציעס זענען קאָנצענטרירט געוואָרן צו ~2 מל אין אַן Amicon 100,000 MWCO צענטריפוגאַל פילטער, און אָנגעפילט מיט 1.5 CV IMAC אין פֿאָרויס בופער יקוויליברייטיד סופּערדעקס 200 16/600 גרייס אויסשליסונג קאָלום, און דערנאָך עלוטירט אין דעם זעלבן בופער איבער 1.5 CV. זאַמלט די אַבזאָרפּציע ספּעקטראַ פון די גרייס-אויסשליסונג פראַקציעס און קאָנצענטרירט די אַבזאָרפּציע ספּעקטראַ מיט A880/A280 פאַרהעלטענישן איבער 2.1 און A880/A805 פאַרהעלטענישן איבער 4.6 ביז 100 A880, וועלכע ווערן גלייך גענוצט פֿאַר פֿאַרפֿרוירענע TEM גריד צוגרייטונג אָדער געהאַלטן ביי -80°C ביז נויטיק.
א לייקאַ EM GP אימערשאַן פריזער איז גענוצט געוואָרן צו צוגרייטן נידעריק-טעמפּעראַטור TEM גרידס. דער קאָמפּלעקס איז געוואָרן פארדיןנט אין IMAC באַפער צו A880 פון 50, און דערנאָך איז 5μl געוואָרן אַריינגעלאָדן אויף אַ ניי גלאָו-אויסגעלאָדן QUANTIFOIL 1.2/1.3 קאַרבאָן-באדעקט קופּער מעש (אַגאַר סייענטיפיק, פֿאַראייניקטע קעניגרייך). אינקובירט די גריד ביי 20°C און 60% רעלאַטיווע הומידיטי פֿאַר 30 סעקונדעס, דערנאָך טרוקנט עס אויס פֿאַר 3 סעקונדעס, און דערנאָך לאָזט עס אָפּקוועטשן אין פליסיקן עטאַן ביי -176°C.
די דאַטן פון די RC-LH114-W קאָמפּלעקס איז רעקאָרדירט ​​געוואָרן אויף די eBIC (עלעקטראָניש ביאָימאַדזשינג צענטער) (בריטיש דיאַמאָנד ליכט מקור) מיט אַ טיטאַן קריאָס מיקראָסקאָפּ, וואָס אַרבעט ביי אַן אַקסעלערירנדיק וואָולטאַזש פון 300kV, מיט אַ נאָמינאַלער מאַגניפיקאַציע פון ​​130,000× און אַן ענערגיע פון ​​- קלייַבן אַ גאַפּ פון 20 eV. א גאַטאַן 968 GIF קוואַנטום מיט K2 שפּיץ דעטעקטאָר איז געניצט געוואָרן צו רעקאָרדירן בילדער אין ציילן מאָדע צו זאַמלען דאַטן. די קאַליברירטע פּיקסעל גרייס איז 1.048Å, און די דאָזע קורס איז 3.83 e-Å-2s-1. געזאַמלט דעם פֿילם אין 11 סעקונדעס און צעטיילט עס אין 40 טיילן. ניצן די קאַרבאָן-באדעקטע געגנט צו ריפאָוקוסירן דעם מיקראָסקאָפּ, און דערנאָך זאַמלען דריי פֿילמען פּער לאָך. אין גאַנצן, 3130 פֿילמען זענען געזאַמלט געוואָרן, מיט דעפאָוקוס ווערטן צווישן -1 און -3μm.
די דאַטן פֿאַר דעם RC-LH116 קאָמפּלעקס זענען געזאַמלט געוואָרן מיטן זעלבן מיקראָסקאָפּ בײַם אַסטערבערי ביאָסטרוקטור לאַבאָראַטאָריע (אוניווערסיטעט פֿון לידז, פֿאַראייניקטע קעניגרייך). די דאַטן זענען געזאַמלט געוואָרן אין צייל-מאָדוס מיט אַ פֿאַרגרעסערונג פֿון 130 ק, און די פּיקסעל גרייס איז קאַליברירט געוואָרן צו 1.065 Å מיט אַ דאָזע פֿון 4.6 e-Å-2s-1. דער פֿילם איז רעקאָרדירט ​​געוואָרן אין 12 סעקונדעס און צעטיילט אין 48 טיילן. אין גאַנצן זענען 3359 פֿילמען געזאַמלט געוואָרן, מיט דעפֿאָקוס ווערטן צווישן -1 און -3μm.
אלע דאטן באארבעטונג ווערט דורכגעפירט אין דער Relion 3.0 פּייפּליין (42). ניצט Motioncorr 2 (43) צו פאררעכטן די שטראל באוועגונג דורך דאָזע וואָג, און דערנאָך ניצט CTFFIND 4.1 (44) צו באַשטימען דעם CTF (קאָנטראַסט טראַנספער פונקציע) פּאַראַמעטער. טיפּישע פאָטאָמיקראָגראַפס נאָך די ערשטע באארבעטונג סטאַגעס ווערן געוויזן אין פיגור 2. S16. די אויטאָמאַטישע סעלעקציע טעמפּלאַט ווערט דזשענערירט דורך מאַנועל סעלעקטינג וועגן 250 פּיקסעלס פון 1000 פּאַרטיקאַלז אין אַ 250-פּיקסעל ראַם און קיין רעפערענץ צוויי-דימענסיאָנאַלע (2D) קלאַסיפיקאַציע, דערמיט אָפּוואַרפנדיק די קלאַסיפיקאַציעס וואָס טרעפן מוסטער קאַנטאַמאַניישאַן אָדער האָבן קיין באַמערקבאַר קעראַקטעריסטיקס. דערנאָך, אויטאָמאַטישע סעלעקציע איז דורכגעפירט אויף אַלע די מיקראָפאָטאָגראַפס, און די RC-LH114-W איז געווען 849,359 פּאַרטיקאַלז, און די RC-LH116 קאָמפּלעקס איז געווען 476,547 פּאַרטיקאַלז. אלע אויסגעקליבענע פארטיקלען האבן דורכגעגאנגען צוויי רונדעס פון נישט-רעפערענץ 2D קלאסיפיקאציע, און נאך יעדן לויף, די פארטיקלען וואס טרעפן די קוילן-געגנט, מוסטער קאנטאמינאציע, קיין קלארע שטריכן אדער שטארק איבערדעקנדיקע פארטיקלען ווערן אפגעווארפן, רעזולטירנדיג אין 772,033 (90.9%) און 359,678 (75.5%). פארטיקלען ווערן גענוצט פאר 3D קלאסיפיקאציע פון ​​RC-LH114-W און RC-LH116 בהתאמה. דער ערשטער 3D רעפערענץ מאדעל איז גענערירט געווארן מיטן סטאכאסטישן גראדיענט אראפגאנג מעטאד. ניצנדיג דעם ערשטן מאדעל אלס א רעפערענץ, ווערן די אויסגעקליבענע פארטיקלען קלאסיפיצירט אין פיר קאטעגאריעס אין 3D. ניצנדיג דעם מאדעל אין דעם קאטעגאריע אלס א רעפערענץ, דורכפירט 3D ראפינירן אויף די פארטיקלען אין דער גרעסטער קאטעגאריע, דערנאך נוצט דעם ערשטן 15Å נידריג-פאס פילטער צו באדעקן דעם סאלווענט געגנט, לייגט צו 6 פיקסעלן פון ווייכע עדזשאַז, און נאך-פראצעסירט די פיקסעלן צו קארעקטירן די גאטאן K2 שפיץ מאדולאציע טראנספער פונקציע פון ​​דעם אויבערשטן דעטעקטאָר. פארן RC-LH114-W דאטן-זאמלונג, איז דאס ערשטע מאדעל מאדיפיצירט געווארן דורך אראפנעמען די שטארקע געדיכטקייט ביי די ברעגן פון דער מאסקע (אפגעטיילט פון דער קערן קאמפלעקס געדיכטקייט אין UCSF כימערא). די רעזולטירנדע מאדעלן (די רעזאלוציעס פון RC-LH114-W און RC-LH116 זענען 3.91 און 4.16 Å, בהתאמה) ווערן גענוצט אלס א רעפערענץ פאר דער צווייטער רונדע פון ​​3D קלאסיפיקאציע. די פארטיקלען וואס ווערן גענוצט זענען גרופירט אין דער ערשטער 3D קלאס און אנטהאלטן נישט קיין שטארקע קארעלאציע מיט דער געגנט. איבערלאפונג אדער מאנגל אין קלארע סטרוקטורעלע אייגנשאפטן. נאך דער צווייטער רונדע פון ​​3D קלאסיפיקאציע, איז די קאטעגאריע מיט דער העכסטער רעזאלוציע אויסגעקליבן געווארן [פאר RC-LH114-W, איין קאטעגאריע איז 377,703 פארטיקלען (44.5%), פאר RC-LH116, זענען דא צוויי קאטעגאריעס, א סך הכל פון 260,752 פארטיקלען (54.7%), וואו זיי זענען די זעלבע נאר ווען זיי זענען אויסגעשטעלט נאך דער ערשטער ראטאציע מיט א קליינעם חילוק]. די אויסגעקליבענע פּאַרטיקלען ווערן ווידער-עקסטראַקטירט אין אַ 400-פּיקסעל קעסטל און ראַפינירט דורך 3D ראַפינירן. די סאָלווענט מאַסקע ווערט דזשענערירט מיטן ערשטן 15Å נידעריק-פּאַס פֿילטער, 3 פּיקסעל מאַפּע יקספּאַנשאַן און 3 פּיקסעל ווייכע מאַסקע. ניצנדיק פּער-פּאַרטיקל CTF ראַפינירן, פּער-פּאַרטיקל באַוועגונג קאָרעקציע און די צווייטע רונדע פון ​​פּער-פּאַרטיקל CTF ראַפינירן, ווערן 3D ראַפינירן, סאָלווענט מאַסקינג און נאָך-פּראַסעסינג דורכגעפֿירט נאָך יעדן שריט צו ווייטער ראַפינירן די רעזולטאַט טעקסטור. ניצנדיק דעם FSC (Fourie Shell Correlation Coefficient) קאַט-אָף ווערט פון 0.143, זענען די רעזאָלוציעס פון די לעצטע מאָדעלן פון RC-LH114-W און RC-LH116 2.65 און 2.80Å, ריספּעקטיוולי. די FSC קורווע פון ​​דעם לעצטן מאָדעל ווערט געוויזן אין בילד 2. S17.
אלע פּראָטעין סיקוואַנסן זענען דאַונלאָודיד פֿון UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) איז געניצט געוואָרן צו קאָנסטרויִרן אַ האָמאָלאָגי מאָדעל פֿון RC, וואָס כּולל די פּראָטעין סיקוואַנסן פֿון RC-L, RC-M און RC-H און די קריסטאַל סטרוקטור פֿון Rba. sphaeroides RC איז געניצט געוואָרן ווי אַ טעמפּלאַט (PDB ID: 5LSE) (46). ניצט דעם "fit map" געצייג אין UCSF Chimera צו צופּאַסן דעם גענערירטן מאָדעל צו דער מאַפּע (47), פֿאַרבעסערן די פּראָטעין סטרוקטור, און קאָפאַקטאָר [4×BChl a (מאָנאָמער ביבליאָטעק רעזידוע נאָמען = BCL), 2×BPh a (BPH), איין אָדער צוויי מינים UQ10 (U10), איין ניט-העמע אייַזן (Fe) און איין 3,4-דיהידראָהעקסאַקאַרבאָנילטשאָלין (QAK)] ניצט Coot (48) צו צולייגן. זינט QAK איז נישט פֿאַראַן אין דער מאָנאָמער ביבליאָטעק, איז עס פּאַראַמעטריזירט געוואָרן מיטן eLBOW געצייג אין PHENIX (49).
דערנאך איז די LH1 סוביוניט קאנסטרואירט געווארן. אנפאנגס איז די אויטאמאטישע קאנסטרוקציע געצייג אין PHENIX (49) גענוצט געווארן צו אויטאמאטיש קאנסטרואירן א טייל פון די LH1 סיקווענס ניצנדיג די מאפע און די LH1-α און LH1-β פראטעין סיקווענסעס אלס אינפוט. אויסקלייבן די מערסט פולשטענדיגע LH1 סוביוניט, עקסטראקטירן עס און לאדן עס אריין אין Coot, מאנועל צולייגן די פעלנדע סיקווענס אין איר, און מאנועל פארבעסערן די גאנצע סטרוקטור איידער צולייגן צוויי BCls a (BCL) און א ספּירילאקסאנטין (CRT) [לויט די באטרעפנדע Rps די געדיכטקייט פון די LH1 קאמפלעקס און די באקאנטע קאראטענאיד אינהאלט. ספעציעס (17)]. קאפירן די פולשטענדיגע LH1 סוביוניט, און נוצן די UCSF כימערא "דאקינג מאפע געצייג" צו דאקן אין די ארומיגע נישט-מאדעל געגנט פון LH1 געדיכטקייט, און דערנאך פארבעסערן עס אין Coot; איבערחזרן דעם פראצעס ביז אלע LH1 סוביוניטס זענען מאדעלירט געווארן. פאר דער RC-LH114-W סטרוקטור, דורך עקסטראקטירן די נישט-אלאקירטע געדיכטקייט אין דעם קוט, ווערט דאס פראטעין סעגמענטירט פון די פארבליבענע נישט-פראטעין קאמפאנענטן אין דער USCF כימערא מאפע און דער אויטאבוילד געצייג ווערט גענוצט צו אויפשטעלן דעם ערשטן מאדעל, און די פארבליבענע סוביוניטס (פראטעין-W) מאדעלירן. אין PHENIX (49). לייג צו יעדע פעלנדע סיקווענצן צום רעזולטירנדיקן מאדעל אין קוט (48), און דערנאך מאנועל פארבעסערן דעם גאנצן סוביוניט. די פארבליבענע נישט-אלאקירטע געדיכטקייט פאסט צו דער קאמבינאציע פון ​​ליפידן (PDB מאנמער ביבליאטעק ID פון CDL = CDL, POPC = 6PL און POPG = PGT), β-DDM דיטערדזשענט (LMT) און UQ10 מאלעקולן (U10). ניצט PHENIX אפטימיזאציע (49) און מאנועלע אפטימיזאציע אין קוט (48) צו פארפעסטיקן דעם גאנצן ערשטן מאדעל ביז די מאדעל סטאטיסטיק און די וויזועלע קוואליטעט פון דעם פאס קען נישט ווייטער פארבעסערט ווערן. צום סוף, ניצט LocScale (50) צו שאַרפן די לאקאלע מאפע, און דערנאך דורכפירן עטלעכע אנדערע ציקלען פון מאדעלירן די נישט-אלאקירטע געדיכטקייט און אויטאמאטישע און מאנועלע אפטימיזאציע.
די ריספּעקטיווע פּעפּטיידן, קאָפאַקטאָרן און אַנדערע ליפּידן און קווינאָנען וואָס זענען צוזאַמענגעבונדן אין זייערע ריספּעקטיווע געדיכטקייטן ווערן געוויזן אין פיגורן 1 און 2. S18 ביז S23. די סטאַטיסטישע אינפֿאָרמאַציע פֿון דעם לעצטן מאָדעל ווערט געוויזן אין טאַבעלע S1.
אויב נישט אַנדערש ספּעציפֿירט, די UV/Vis/NIR אַבזאָרפּציע ספּעקטראַ זענען געזאַמלט געוואָרן אויף אַ Cary60 ספּעקטראָפֿאָטאָמעטער (Agilent, USA) אין 1 נם אינטערוואַלן פֿון 250 נם ביז 1000 נם און אַן אינטעגראַציע צייט פֿון 0.1 סעקונדעס.
פארדיןען דעם מוסטער אין א קוואַרץ קיוועט מיט א 2 מ״מ וועג צו A880 פון 1, און זאַמלען דעם אַבזאָרפּציע ספּעקטרום צווישן 400 און 1000 נ״מ. די קייַלעכדיקע דיכראָישע ספּעקטראַ זענען געזאַמלט געוואָרן אויף אַ דזשאַסקאָ 810 ספּעקטראָפּאָלאַרימעטער (דזשאַסקאָ, יאַפּאַן) ביי 1 נ״מ אינטערוואַלן צווישן 400 נ״מ און 950 נ״מ מיט אַ סקען קורס פון 20 נ״מ מין-1.
דער מאָלאַרער עקסטינקציע קאָעפיציענט ווערט באַשטימט דורך פֿאַרדיןען דעם קערן קאָמפּלעקס צו אַן A880 פֿון בערך 50. פֿאַרדיןען דעם 10μl וואָלומען אין 990μl בינדינג באַפֿער אָדער מעטאַנאָל, און זאַמלען דעם אַבזאָרפּציע ספּעקטרום גלייך צו מינימיזירן BChl דעגראַדאַציע. דער BChl אינהאַלט פֿון יעדן מעטאַנאָל מוסטער איז געווען קאַלקיאַלייטיד דורך דעם עקסטינקציע קאָעפיציענט ביי 771 נם פֿון 54.8 mM-1 cm-1, און דער עקסטינקציע קאָעפיציענט איז באַשטימט געוואָרן (51). טיילן די געמאָסטענע BChl קאָנצענטראַציע מיט 32 (RC-LH114-W) אָדער 36 (RC-LH116) צו באַשטימען די קערן קאָמפּלעקס קאָנצענטראַציע, וואָס ווערט דערנאָך געניצט צו באַשטימען דעם אַבזאָרפּציע ספּעקטרום פֿון דעם זעלבן מוסטער געזאַמלט אין דעם באַפֿער פּאַראַלעל. דריי איבערגעחזרטע מעסטונגען זענען גענומען געוואָרן פֿאַר יעדן מוסטער, און די דורכשניטלעכע אַבזאָרבאַנס פֿון דעם BChl Qy מאַקסימום איז געניצט געוואָרן פֿאַר קאַלקולאַציע. דער עקסטינקציע קאָעפיציענט פון RC-LH114-W געמאָסטן ביי 878 נם איז 3280±140 mM-1 cm-1, בשעת דער עקסטינקציע קאָעפיציענט פון RC-LH116 געמאָסטן ביי 880 נם איז 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 איז קוואַנטיפיצירט געוואָרן לויט דער מעטאָדע אין (52). אין קורצן, ריווערס-פאַזע HPLC (RP-HPLC) איז דורכגעפירט געוואָרן מיטן Agilent 1200 HPLC סיסטעם. צעלאָזט אויף בערך 0.02 נמאָל פון RC-LH116 אדער RC-LH114-W אין 50μl פון 50:50 מעטאַנאָל:כלאָראָפאָרם וואָס ענטהאַלט 0.02% (w/v) פעריק כלאָריד, און אינדזשעקטירט דעם פאַר-עקוויליברירטן Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm צעלאָזט אין 1 מל-1 מינוט-1 ביי 40°C אין HPLC סאָלווענט (80:20 מעטאַנאָל:2-פּראָפּאַנאָל) אויף אַ ×25 סענטימעטער קאָלום. דורכפירט אַן איזאָקראַטישע עלוציע אין אַ HPLC סאָלווענט צו מאָניטאָרירן אַבסאָרבאַנס ביי 275 נם (UQ10), 450 נם (קאַראָטענאָידן) און 780 נם (BChl) פֿאַר 1 שעה. דער שפּיץ אין דעם 275 נאַנאָמעטער כראָמאַטאָגראַם ביי 25.5 מינוט איז געווען אינטעגרירט, וואָס האָט נישט ענטהאַלטן קיין אַנדערע דעטעקטירבארע קאַמפּאַונדז. די אינטעגרירטע שטח ווערט גענוצט צו רעכענען די מאָלאַרע סומע פון ​​UQ10 עקסטראַקטירט מיט רעפֿערענץ צו דער קאַליבראַציע קורווע קאַלקולירט פון דער ינדזשעקשאַן פון ריינע סטאַנדאַרדס פון 0 ביז 5.8 נמאָל (פיגור S14). יעדער מוסטער איז געווען אַנאַליזירט אין דריי רעפּליקאַטעס, און די געמאָלדענע טעות קאָרעספּאָנדירט צו די SD פון די דורכשניט.
א לייזונג וואס אנטהאלט דעם RC-LH1 קאמפלעקס מיט א מאקסימום Qy אבסארפציע פון ​​0.1 איז צוגעגרייט געווארן מיט 30 μM רעדוצירטן פערד הארץ ציטאכראם c2 (מערק, פאראייניגטע קעניגרייך) און 0 ביז 50 μMUQ2 (מערק, פאראייניגטע קעניגרייך). דריי 1-מל מוסטערן זענען צוגעגרייט געווארן ביי יעדער UQ2 קאנצענטראציע און אינקובירט איבערנאכט אין דער פינצטערניש ביי 4°C צו פארזיכערן א פולשטענדיגע אדאפטאציע צו דער פינצטערניש פארן מעסטונג. די לייזונג איז אריינגעלאדן געווארן אין אן OLIS RSM1000 מאדולארן ספעקטראפאטאמעטער אויסגעשטאט מיט א 300 נ"מ פלאם/500 ליניע גראַטינג, 1.24 מ"מ אריינגאנג, 0.12 מ"מ מיטל און 0.6 מ"מ ארויסגאנג שפאלטן. א 600 נ"מ לאנגער דורכגאנג פילטער איז געשטעלט ביים אריינגאנג פון דער מוסטער פאטא-רער און דער רעפערענץ פאטא-מולטיפליער רער צו אויסשליסן עקסייטאציע ליכט. די אבסארפציע איז מאָניטאָרירט געווארן ביי 550 נ"מ מיט אן אינטעגראציע צייט פון 0.15 סעקונדעס. דאס אויפרעגונג ליכט ווערט ארויסגעלאזט פון די 880 נאַנאָמעטער M880F2 LED (ליכט ארויסגעלאזנדיקע דיאָדע) (Thorlabs Ltd., UK) דורך א פיבער-אפטישן קאבל ביי 90% אינטענסיטעט דורך א DC2200 קאנטראלער (Thorlabs Ltd., UK) און ווערט ארויסגעלאזט צו דער ליכט-מקור ביי א ווינקל פון 90°. דער מעסט-שטראַל איז קעגן דעם שפּיגל צו צוריקגעבן יעדן ליכט וואָס איז נישט אָנהייב אַבזאָרבירט געוואָרן דורך דעם מוסטער. מאָניטאָרירט די אַבזאָרבאַנס 10 סעקונדעס איידער די באַלויכטונג פון 50 סעקונדעס. דערנאָך איז די אַבזאָרבאַנס ווייטער מאָניטאָרירט געוואָרן פֿאַר 60 סעקונדעס אין דער פינצטערניש צו אָפּשאַצן די מאָס אין וואָס קווינאָלאָל רעדוצירט ספּאָנטאַן ציטאָכראָם c23+ (זע בילד S8 פֿאַר רויע דאַטן).
די דאַטן זענען פּראַסעסט געוואָרן דורך צופּאַסן אַ לינעאַרע אָנהייב ראַטע אין 0.5 ביז 10 סעקונדעס (אָפּהענגיק פון דער UQ2 קאָנצענטראַציע) און דורכשניטלעך רעכענען די ראַטעס פון אַלע דריי מוסטערן ביי יעדער UQ2 קאָנצענטראַציע. די RC-LH1 קאָנצענטראַציע קאַלקולירט דורך די ריספּעקטיוו עקסטינשאַן קאָואַפישאַנט איז געניצט צו קאָנווערטירן די ראַטע אין די קאַטאַליטישע עפעקטיווקייט, פּלאַטיד אין Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), און צוגעפּאַסט צו די Michaelis-Menten מאָדעל צו באַשטימען די אויסזעענדיקע Km און Kcat ווערטן.
פֿאַר טראַנזיענט אַבזאָרפּשאַן מעסטונגען, איז די RC-LH1 מוסטער פֿאַרדיןנט געוואָרן צו ~2μM אין IMAC באַפֿער מיט 50 mM נאַטריום אַסקאָרבאַט (Merck, USA) און 0.4 mM טערבוטין (Merck, USA). אַסקאָרביק זויער ווערט גענוצט ווי אַ קרבן עלעקטראָן דאָנאָר, און טערט-בוטאַקלאָפֿען ווערט גענוצט ווי אַ QB אינהיביטאָר צו ענשור אַז דער הויפּט RC דאָנאָר בלייבט רידוסט (דאָס הייסט, נישט פֿאָטאָאַקסידייזד) איבער דעם גאַנצן מעסטונג פּראָצעס. אַפּראָקסימאַטלי 3 מל פֿון מוסטער ווערט צוגעגעבן צו אַ מנהג ראָטייטינג צעל (אַרום 0.1 עם אין דיאַמעטער, 350 RPM) מיט אַ 2 מם אָפּטישער דרך לענג צו ענשור אַז די מוסטער אין די לאַזער דרך האט גענוג צייט פֿאַר טונקל אַדאַפּטיישאַן צווישן עקסייטיישאַן פּאַלסיז. ניצט ~100-fs לאַזער פּאַלסיז צו אַמפּליפֿייערן די Ti: Sapphire לאַזער סיסטעם (Spectra Physics, USA) צו עקסייט די מוסטער ביי 880 nm מיט אַ רעפּעטיציע קורס פֿון 1 kHz (20 nJ פֿאַר NIR אָדער 100 nJ פֿאַר Vis). איידער זאַמלען דאַטן, אויסשטעלן די מוסטער צו עקסייטיישאַן ליכט פֿאַר אַרום 30 מינוט. אויסשטעלונג וועט פאַראורזאַכן QA אינאַקטיוואַציע (מעגלעך רעדוצירן QA איין אָדער צוויי מאָל). אָבער ביטע באַמערקן אַז דעם פּראָצעס איז ריווערסאַבאַל ווייַל נאָך אַ לאַנג פּעריאָד פון טונקל אַדאַפּטיישאַן, וועט RC שטייטלעך צוריקקומען צו QA טעטיקייט. א Helios ספּעקטראָמעטער (Ultrafast Systems, USA) איז געניצט צו מעסטן טראַנזיענט ספּעקטראַ מיט אַ פאַרהאַלטונג צייט פון -10 צו 7000 ps. ניצן Surface Xplorer ווייכווארג (Ultrafast Systems, USA) צו אַנגרופּירן די דאַטן סעץ, און דאַן צונויפגיסן און סטאַנדאַרדיזירן. ניצן די CarpetView ווייכווארג פּעקל (Light Conversion Ltd., ליטע) צו נוצן די קאַמביינד דאַטן סעט צו באַקומען דיפערענטשאַל ספּעקטראַ שייך צו דיקיי, אָדער נוצן אַ פונקציע וואָס קאָנוואַלווז קייפל עקספּאָנענטן מיט די ינסטרומענט ענטפער צו פּאַסיק די איין-כוואַליע לענג ספּעקטראַל עוואָלוציע אין Origin (OriginLab, USA).
ווי דערמאנט אויבן (53), איז צוגעגרייט געוואָרן אַ פאָטאָסינטעטישע פילם וואָס אנטהאלט LH1 קאָמפּלעקס אָן ביידע RC און פּעריפערישע LH2 אַנטענע. די מעמבראַנע איז פארדיןנט געוואָרן אין 20 mM טריס (pH 8.0) און דערנאָך אַריינגעלאָדן אין אַ קוואַרץ קיווועט מיט אַ 2 מם אָפּטישן וועג. אַ 30nJ לאַזער פּולס איז געניצט געוואָרן צו עקסייטירן דעם מוסטער ביי 540 נם מיט אַ פאַרהאַלטונג צייט פון -10 ביז 7000 ps. פּראָצעסירט דעם דאַטן סעט ווי באַשריבן פֿאַר Rps. pal מוסטער.
די מעמבראַן איז געוואָרן פּעלעטירט דורך צענטריפוגאַציע ביי 150,000 RCF פֿאַר 2 שעה ביי 4°C, און דערנאָך איז איר אַבזאָרבאַנס ביי 880 נם ווידער אויפגעהענגט געוואָרן אין 20 mM טריס-HCl (pH 8.0) און 200 mM NaCl. צעלאָזט די מעמבראַן דורך לאַנגזאַם אַריינמישן 2% (w/v) β-DDM פֿאַר 1 שעה אין דער פינצטער ביי 4°C. די מוסטער איז געוואָרן פֿאַרדיןנט אין 100 mM טריעטילאַמאָניום קאַרבאָנאַט (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) צו אַ פּראָטעין קאָנצענטראַציע פון ​​2.5 מג מל-1 (Bio-Rad אַנאַליז). ווייטערדיקע פּראָצעסירונג איז דורכגעפירט געוואָרן פֿון דער פֿריִער פֿאַרעפֿנטלעכטער מעטאָדע (54), אָנהייבנדיק מיטן פֿאַרדיןן פֿון 50 μg פּראָטעין אין אַ סך הכל פֿון 50 μl TEAB וואָס ענטהאַלט 1% (w/v) נאַטריום לאַוראַט (Merck, UK). נאך סאָניקאַציע פאר 60 סעקונדעס, איז עס רעדוצירט געוואָרן מיט 5 mM טריס(2-קאַרבאָקסיעטיל)פאָספין (מערק, פֿאַראייניקטע קעניגרייך) ביי 37°C פאר 30 מינוט. פאר S-אַלקילאַציע, אינקובירט דעם מוסטער מיט 10 mM מעטיל S-מעטילטהיאָמעטהאַנסולפאָנאַט (מערק, פֿאַראייניקטע קעניגרייך) און לייגט עס צו פון א 200 mM איזאָפּראָפּאַנאָל סטאַק לייזונג פאר 10 מינוט ביי צימער טעמפּעראַטור. פּראָטעאָליטישע דיידזשעסטשאַן איז דורכגעפירט געוואָרן דורך צולייגן 2 μg טריפּסין/ענדאָפּראָטעינאַזע ליס-C געמיש (פּראָמעגאַ פֿאַראייניקטע קעניגרייך) און אינקובירט ביי 37°C פאר 3 שעה. דער לאַוראַט סורפאַקטאַנט איז עקסטראַקטירט געוואָרן דורך צולייגן 50 μl עטיל אַצעטאַט און 10 μl 10% (v/v) LC גראַד טריפלאָראָאַסעטיק זויער (TFA; טערמאָ פישער סייענטיפיק, פֿאַראייניקטע קעניגרייך) און וואָרטעקסן פאר 60 סעקונדעס. די פאַזע צעשיידונג איז פּראָמאָווירט געוואָרן דורך צענטריפוגאַציע ביי 15,700 RCF פאר 5 מינוט. לויטן פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט, איז גענוצט געוואָרן אַ C18 ספּין קאָלום (טהערמאָ פֿישער סייענטיפיק, פֿאַראייניקטע קעניגרייך) צו פֿאָרזיכטיק אַספּירירן און אַנטזאַלצן די נידעריקער פֿאַזע וואָס ענטהאַלט דעם פּעפּטיד. נאָך טריקענען דורך וואַקוום צענטריפוגאַציע, איז די מוסטער אויפֿגעלייזט געוואָרן אין 0.5% TFA און 3% אַצעטאָניטריל, און 500 נ״ג איז אַנאַליזירט געוואָרן דורך נאַנאָפֿלאָו RP כראָמאַטאָגראַפֿיע צוזאַמען מיט מאַסע ספּעקטראָמעטריע ניצנדיק די סיסטעם פּאַראַמעטערס וואָס זענען פֿריִער דעטאַלירט געוואָרן.
ניצט MaxQuant v.1.5.3.30 (56) פאר פּראָטעין אידענטיפיקאציע און קוואנטיפיקאציע צו זוכן פאר Rps. palustris פּראָטעאָמע דאַטאַבייס (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). די מאַסע ספּעקטראָמעטרי פּראָטעאָמיקס דאַטן זענען דעפּאַזיטירט געוואָרן אין די ProteomeXchange Alliance דורך די PRIDE פּאַרטנער רעפּאָזיטאָרי (http://proteomecentral.proteomexchange.org) אונטער די דאַטאַסעט אידענטיפיצירער PXD020402.
פֿאַר אַנאַליז דורך RPLC צוזאַמען מיט עלעקטראָספּריי יאָניזאַציע מאַסע ספּעקטראָמעטריע, איז דער RC-LH1 קאָמפּלעקס צוגעגרייט געוואָרן פֿון ווילד-טיפּ Rps. ניצנדיק דעם פֿריִער פֿאַרעפֿנטלעכטן מעטאָד (16), איז די פּראָטעין קאָנצענטראַציע פּראָדוצירט אין פּאַלוסטריס צעלן געווען 2 מג מל-1 אין 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl און 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad אַנאַליז)) DDM. לויטן פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט, ניצט אַ 2D רייניקונג קיט (GE Healthcare, USA) צו עקסטראַקטירן 10 μg פּראָטעין דורך דעם אָפּזאַץ מעטאָד, און צעלאָזט דעם אָפּזאַץ אין 20 μl 60% (v / v) פֿאָרמיק זויער (FA), 20% (v / v) אַצעטאָניטריל און 20% (v/v) וואַסער. פֿינף מיקראָליטער זענען אַנאַליזירט געוואָרן דורך RPLC (Dionex RSLC) צוזאַמען מיט מאַסע ספּעקטראָמעטריע (Maxis UHR-TOF, Bruker). ניצט MabPac 1.2×100 מ״מ קאָלום (Thermo Fisher Scientific, UK) פֿאַר צעשיידונג ביי 60°C און 100μlmin -1, מיט אַ גראַדיענט פון 85% (v / v) סאָלווענט A [0.1% (v / v) FA און 0.02% (V/v) TFA וואַסעריגע לייזונג] צו 85%(v/v) סאָלווענט B [0.1%(v/v) FA און 0.02%(v/v) אין 90%(v/v) אַצעטאָניטריל TFA]. ניצנדיק אַ נאָרמאַלע עלעקטראָספּריי ייאַניזאַציע מקור און פעליקייַט פּאַראַמעטערס פֿאַר מער ווי 60 מינוט, באַקומט דער מאַסע ספּעקטראָמעטער 100 ביז 2750 m/z (מאַסע-צו-לאָדונג פאַרהעלטעניש). מיט דער הילף פון די ExPASy ביאָאינפאָרמאַטיקס רעסורס פּאָרטאַל FindPept געצייַג (https://web.expasy.org/findpept/), מאַפּירט דעם מאַסע ספּעקטרום צו די סוביוניץ פון דעם קאָמפּלעקס.
די צעלן זענען געוואקסן פאר 72 שעה אונטער 100 מל NF-נידעריק (10μMm-2 s-1), מיטל (30μMm-2 s-1) אדער הויך (300μMm-2 s-1) ליכט. M22 מיטל (M22 מיטל אין וועלכן אַמאָוניום סולפֿאַט איז אויסגעלאָזט און נאַטריום סוקסינאַט איז ריפּלייסט דורך נאַטריום אַצעטאַט) אין אַ 100 מל שרויף-דעקל פלאַש (23). אין פינף 30-סעקונדן ציקלען, 0.1 מיקראָן גלאז קרעלן זענען געווען קרעלן אין אַ וואָלומען פאַרהעלטעניש פון 1:1 צו ליזירן די צעלן און קיל אויף אייז פאר 5 מינוט. די נישט-לעזלעכע מאַטעריע, נישט-געבראָכענע צעלן און גלאז קרעלן זענען אַוועקגענומען דורך צענטריפוגאַציע ביי 16,000 RCF פאר 10 מינוט אין אַ בענטשטאָפּ מיקראָצענטריפוגע. די מעמבראַן איז געוואָרן אפגעשיידט אין אַ Ti 70.1 ראָטאָר מיט 100,000 RCF אין 20 mM טריס-HCl (pH 8.0) מיט אַ 40/15% (w/w) סוכראָז גראַדיענט פֿאַר 10 שעה.
ווי באשריבן אין אונדזער פריערדיקער ארבעט, אימונאָדעטעקציע פון ​​דעם His טאַג אויף PufW (16). אין קורצן, דער פּיוראַפייד קערן קאָמפּלעקס (11.8 nM) אָדער די מעמבראַנע וואָס כּולל די זעלבע קאָנצענטראַציע פון ​​RC (באַשטימט דורך אַקסאַדיישאַן, סובטראַקטינג דעם רידוסט דיפערענס ספּעקטרום און מאַטשינג די לאָוד אויף דעם געפאַרבטן געל) אין 2x SDS לאָודינג באַפער (Merck, UK) איז דיילוטאַד צוויי מאָל. די פּראָטעאינען זענען אפגעשיידט אויף אַ רעפּליקע 12% ביס-טריס נופּאַגע געל (Thermo Fisher Scientific, UK). אַ געל איז געפאַרבט מיט Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) צו לאָדן און וויזואַליזירן די RC-L סוביוניט. דער פּראָטעין אויף דעם צווייטן געל איז טראַנספערד צו מעטאַנאָל-אַקטיווייטיד פּאָליווינילידען פלאָריד (PVDF) מעמבראַנע (Thermo Fisher Scientific, UK) פֿאַר אימונאָאַסיי. די PVDF מעמבראַנע איז געוואָרן בלאָקירט אין 50 mM טריס-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 און 5% (w / v) אָפּגעשעפּטע מילך פּודער, און דערנאָך אינקובירט מיטן אַנטי-His ערשטיקן אַנטיבאָדי (אין דילוט דעם אַנטיבאָדי באַפער [50 mM טריס-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl און 0.05% (v/v) Tween-20] אין 1:1000 A190-114A, בעטיל לאַבאָראַטאָריעס, USA) פֿאַר 4 שעה. נאך וואשן 3 מאל פאר 5 מינוט אין אנטיקערפער בופער, איז די מעמבראן קאמבינירט געווארן מיט כריין פעראקסידאז (סיגמא-אלדריך, פאראייניגטע קעניגרייך) אנטי-מויז צווייטיק אנטיקערפער (פארדיןנט 1:10,000 אין אנטיקערפער בופער). אינקובירט צו דערמעגלעכן דעטעקציע (5 מינוט נאך 3 וואשן אין אנטיקערפער בופער) ניצנדיג WESTAR ETA C 2.0 כעמילומינעסענס סובסטראט (סיאנאגען, איטאליע) און עמערשאם אימעדזשער 600 (GE העאַלטהקער, פאראייניגטע קעניגרייך).
דורך צייכענען די אינטענסיטעט פארטיילונג פון יעדן געפארבטן געל אדער אימונאסיי ליין, אינטעגרירן דעם שטח אונטערן שפיץ און אויסרעכענען דעם אינטענסיטעט פארהעלטעניש פון RC-L (געפארבטן געל) און פראטעין-W (אימונאסיי), אין ImageJ (57) פראצעסירן דאס בילד. די פארהעלטענישן זענען געווארן פארוואנדלט צו מאלארע פארהעלטענישן דורך אננעמען אז דער פארהעלטעניש פון RC-L צו פראטעין-W אין דעם ריינעם RC-LH114-W מוסטער איז געווען 1:1 און נארמאליזירן דעם גאנצן דאטן סעט לויט דעם.
פֿאַר נאָך מאַטעריאַלן פֿאַר דעם אַרטיקל, ביטע זען http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
דאָס איז אַן אָפֿן-אַקסעס אַרטיקל פֿאַרשפּרייט אונטער די באַדינגונגען פֿון דער Creative Commons Attribution License. דער אַרטיקל ערלויבט אַנלימיטעד נוצן, פֿאַרשפּרייטונג און רעפּראָדוקציע אין יעדן מעדיום אונטער דער באַדינגונג אַז די אָריגינעלע אַרבעט ווערט ריכטיק ציטירט.
נאטיץ: מיר בעטן אייך נאר צו געבן אייער בליצפּאָסט אַדרעס, אַזוי אַז דער מענטש וואָס איר רעקאָמענדירט צו דער בלאַט זאָל וויסן אַז איר ווילט אַז זיי זאָלן זען דעם בליצפּאָסט און אַז עס איז נישט ספּאַם. מיר וועלן נישט כאַפּן קיין בליצפּאָסט אַדרעסן.
די פראגע ווערט גענוצט צו טעסטן צי איר זענט א באזוכער און צו פארמיידן אויטאמאטישע ספאם אריינשיקונג.
דוד דזש. קעי. סווינסבורי, פארק טשיאן, פיליפ דזש. דזשעקסאן, קייטלין מ. פעריס, דאריוש מ. ניעדזוויעדזקי, עליזאבעט סי. מארטין, דוד א. פארמער, לאָרנאַ א. מאַלאָון, רעבעקאַ פ. טאָמפּסאָן, ניל א. ראַנסאָן, דניאל פּ. קאַניפף, מאַרק דזש. דיקמאַן, דיואי האָלטען, קריסטין קירמייער, ענדרו היטשקאָק, סי. ניל האַנטער
די הויך-רעזאָלוציע סטרוקטור פון די ליכט טראַפּ 1 קאָמפּלעקס אין די רעאַקציע צענטער גיט נייַע ינסייץ אין די כינאָנע דינאַמיק.
דוד דזש. קעי. סווינסבורי, פארק טשיאן, פיליפ דזש. דזשעקסאן, קייטלין מ. פעריס, דאריוש מ. ניעדזוויעדזקי, עליזאבעט סי. מארטין, דוד א. פארמער, לאָרנאַ א. מאַלאָון, רעבעקאַ פ. טאָמפּסאָן, ניל א. ראַנסאָן, דניאל פּ. קאַניפף, מאַרק דזש. דיקמאַן, דיואי האָלטען, קריסטין קירמייער, ענדרו היטשקאָק, סי. ניל האַנטער
די הויך-רעזאָלוציע סטרוקטור פון די ליכט טראַפּ 1 קאָמפּלעקס אין די רעאַקציע צענטער גיט נייַע ינסייץ אין די כינאָנע דינאַמיק.
©2021 אמעריקאנער אַססאָסיאַטיאָן פֿאַר די אַדוואַנסמאַנט פון וויסנשאַפֿט. אַלע רעכט רעזערווירט. AAAS איז אַ שוטעף פון HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef און COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.